【摘要】 目的 探討他克莫司治疗肾病肾小球硬化的分子机制，以及其对足细胞相关分子CD2相关蛋白（CD2AP） 表达的影响。方法 选取30只SD大鼠，随机分为正常对照组（Con组）、嘌呤霉素氨基核苷（PAN） 肾病模型组（PAN组） 以及他克莫司组（FK组），每组10只。除Con组，其余2组均给予一次性腹腔注射PAN制备肾病肾小球硬化模型，模型制备成功后，FK组予他克莫司 0.5 mg/（kg·d）灌胃。给药10 d后检测3组大鼠尿蛋白及血生化指标，收集3组大鼠肾脏组织，光学显微镜下观察大鼠肾脏组织染色的病理形态学改变，并使用蛋白免疫印迹法检测3组肾脏组织CD2AP的相对表达量。结果 成功制造肾病肾小球硬化模型，与Con组比较，PAN组、FK组大鼠均出现大量蛋白尿且血清白蛋白、总胆固醇升高（P均< 0.05）。与PAN组相比，FK组的尿蛋白定量、血清白蛋白及总胆固醇均有所降低（P均< 0.05）。Con组肾小球及肾小管间质结构正常，毛细血管无淤血，肾小管腔内未见管型。PAN组大鼠肾脏可见肾小球毛细血管袢的管腔闭塞、基质增多以及球囊粘连，部分肾小球可见节段性硬化。FK组大鼠肾脏病理改变轻于PAN组。Con组、PAN组、FK组的肾脏组织CD2AP蛋白的相对表达量分别为1.46±0.31、0.72±0.15、1.04±0.23，其中PAN组低于Con组、FK组高于PAN组（P均< 0.05）。结论 CD2AP在PAN肾病大鼠肾脏组织的表达减弱，他克莫司可有效稳定肾脏组织CD2AP的表达，减轻肾损伤程度。
【关键词】 他克莫司;嘌呤霉素氨基核苷;肾小球硬化;CD2相关蛋白
Molecular mechanism of tacrolimus in treatment of glomerulosclerosis by stabilizing CD2AP expression Yu Shengyou， Ren Qi， Yu Li. Department of Pediatric， Guangzhou First People’s Hospital， Guangzhou 510180， China
【Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of tacrolimus in the treatment of glomerulosclerosis and evaluate the effect on the expression level of CD2-associated protein （CD2AP）. Methods Thirty SD rats were randomly and evenly divided into the control group （Con group）， puromycin aminonucleoside group （PAN group） and tacrolimus group （FK group）， respectively. Except the control group， the rats in the remaining two groups were given with intraperitoneal injection of purine aminonucleoside （PAN） to establish the rat models with glomerulosclerosis. After the model was successfully established， intragastric administration of tacrolimus at a dose of 0.5 mg/（kg·d） was given in the tacrolimus group. At 10 d after drug administration， the urine protein and routine blood biochemical parameters of all rats were detected in three groups and the renal tissues were collected and prepared for pathological staining under an optical microscope. The relative expression of CD2AP in the renal tissues was quantitatively measured by Western blot. Results The rat models with glomerulosclerosis were successfully established. Compared with the Con group， a large amount of proteinuria was observed and the expression levels of serum albumin and total cholesterol were significantly elevated in the PAN and FK groups （all P < 0.05）. Compared with the PAN group， the expression levels of urine albuminuria， serum albumin and total cholesterol were considerably decreased in the FK group （all P < 0.05）. In the Con group， the glomerulus and tubulointerstitial structures were normal， no blood congestion was noted in the capillaries and no tubules were found in the renal tubular lumen. In the PAN group， lumen occlusion， increased matrix and balloon adhesion of the glomerular capillary loop were observed， and segmental sclerosis was noted in partial glomeruli. The pathological changes of the kidney in the PAN group were more severe than those in the FK group. The relative expression levels of CD2AP protein in the kidney tissues were 1.46±0.31， 0.72±0.15 and 1.04±0.23 in the Con， PAN and FK groups， respectively. Statistical significance was observed between the PAN and Con groups， and between the FK and PAN groups （both P < 0.05）. Conclusions The expression of CD2AP is down-regulated in the renal tissues of rat models with puromycin-induced nephropathy. Tacrolimus can effectively stabilize the expression of CD2AP in the renal tissues and mitigate the severity of renal injury.
【Key words】 Tacrolimus;Puromycin aminonucleoside;Glomerulosclerosis;CD2-associated protein
目前，国内外研究证实局灶节段性肾小球硬化（FSGS）是多种致病因素长期损害肾小球所导致的微循环障碍，进而引起肾小球的缺血、缺氧，最终损伤肾小球毛细血管的内皮细胞直至肾衰竭，但其具体的病因及发病机制尚不明确[1]。近年研究显示，足细胞相关分子CD2相关蛋白（CD2AP）与肾脏病以及蛋白尿的发生发展密切相关，CD2AP表达与分布的异常与肾小球足细胞足突的消失、融合密切相关[2]。其具体机制尚不明确[3]。在一些遗传性肾病综合征的患儿和体外肾病动物模型中，当敲除肾小球足细胞CD2AP基因后，足细胞的足突发生改变、裂孔隔膜消失，进而导致大量蛋白尿的发生[4-5]。CD2AP在肾病肾小球硬化以及蛋白尿的发生发展中起重要作用。因此，本研究建立大鼠嘌呤霉素氨基核苷（PAN）肾病模型，并应用免疫抑制药他克莫司干预，探讨他克莫司治疗肾病肾小球硬化的分子机制，以及其对CD2AP表达的影响，为多靶点治疗FSGS提供理论和实验依据。
材料与方法
一、实验动物
无特定病原（SPF）级雄性SD大鼠30只（购自中山大学实验动物中心），体质量（230±20）g，2～3月龄（相当于人类幼年至青年）。予自由饮食，SPF环境适应性饲养1周后，采用随机数字表法分为3组：正常对照组（Con组）、PAN肾病模型组（PAN组），他克莫司组（FK组），每组各10只。本动物实验经广州市第一人民医院伦理委员会批准，所有实验操作均遵循实验动物使用的相关伦理要求。
二、方 法
1. 模型制备
参照文献[6]方法，PAN组、FK组大鼠均予一次性腹腔注射PAN（美国Sigma）15 mg/100 g 体质量诱导肾病肾小球硬化模型，对照组给予一次性腹腔注射等量生理盐水，至PAN注射后第10日，尿蛋白达到最高峰，血浆总蛋白和白蛋白明显下降，血清总胆固醇和甘油三酯明显升高，说明成功诱导了肾病模型。肾病模型制备成功后，FK组予他克莫司 0.5 mg/（kg·d）灌胃，每日1次;Con组、PAN组分别予等量生理盐水灌胃，每日1次。
2. 检查内容
均在给药10 d后以尾静脉采血法收集各组大鼠的血液，同时收集器收集尿液。用焦酚红方法测定24 h尿蛋白水平，用日立7600全自动生化分析仪检测血液生化指标，包括白蛋白、总胆固醇、血尿素氮、血清肌酐。
3. 肾脏组织病理学检测
采集血、尿样本后以过量麻醉法（10%水合氯醛）安乐处死大鼠，然后迅速取出其肾脏组织，置于4%甲醛中固定，进行常规脱水、包埋以及切片，苏木素-伊红（HE）染色后，光学显微镜下观察大鼠肾脏组织的病理学改变。
4. 肾脏组织CD2AP蛋白的表达检测
收集上述各组大鼠的肾脏组织，采用蛋白免疫印迹法，用RIPA蛋白提取液（含蛋白酶抑制剂PMSF，申能博采生物科技有限公司）提取大鼠肾脏组织总蛋白，采用BCA蛋白质定量法测定蛋白浓度。每孔加100 μg总蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温封闭120 min，用兔抗CD2AP（美国 Sigma）为一抗4℃孵育过夜，然后用辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG室温反应60 min，使用LumiGLO发光液，胶片曝光、显影、水漂洗、定影，扫描胶片结果导入电脑，分析目的蛋白条带与CD2AP蛋白条带的灰度值的比值作为其相对表达量。
三、统计学处理
使用SPSS 24.0进行分析，正态分布的定量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、3组大鼠的尿蛋白及血生化指标比较
本研究成功制造肾小球硬化肾病模型，与Con组比较，PAN组、FK组大鼠均出现大量蛋白尿，血总胆固醇、血尿素氮升高（P均< 0.05）。与PAN组相比，FK组的24 h尿蛋白定量、血总胆固醇降低，血白蛋白升高（P均< 0.05）。FK组的血白蛋白、总胆固醇和血清肌酐与Con组比较差异均无统计学意义（P均> 0.05），见表1。
二、3组大鼠的肾脏病理比较
Con组大鼠肾小球及肾小管间质结构正常，毛细血管无淤血，肾小管腔内未见管型。PAN组大鼠肾脏可见肾小球毛细血管袢的管腔闭塞、基质增多以及球囊粘连，部分肾小球可见节段性硬化。FK组大鼠肾脏病理改变明显轻于PAN组，主要表现为肾小球系膜细胞和细胞外基质（ECM）增生，炎症细胞浸润，偶见肾小球硬化，见图1。
三、3组大鼠肾脏组织CD2AP蛋白相对表达量比较
Con组、PAN组、FK组的肾脏组织CD2AP蛋白的相对表达量分别为1.46±0.31、0.72±0.15、1.04±0.23，组间比较差异有统计学意义（F = 24.361，P < 0.001），其中PAN組低于Con组、FK组高于PAN组（P均< 0.05），见图2。
讨 论
肾小球硬化是多种慢性肾脏疾病长期作用的结果，也是多种肾病进展至终末期的主要病理基础之一，其主要的病理改变是大量ECM积聚。近年研究显示，肾小球足突细胞裂孔膜上的分子如CD2AP、TRPC6等与肾小球硬化的发生发展密切相关，研究并证实这些足细胞相关分子在肾病蛋白尿的发生过程中起着至关重要作用。目前国外研究已经证实足细胞相关分子CD2AP与肾脏肾小球滤过屏障的关系，发现完全敲除CD2AP等位基因（CD2AP-/-）的小鼠会出现先天性肾病综合征[7]。进一步研究显示，在CD2AP+/-基因敲除小鼠和FSGS患者中，基因突变检测结果证实CD2AP在FSGS的发病中发挥至关重要的作用[8]。CD2AP是一种主要表达于肾小球足突细胞的胞浆蛋白，Nakatsue等（2005年）的研究显示，足细胞CD2AP分子在PAN肾病大鼠模型中的表达降低。近来研究发现，高血压肾脏纤维化患者的肾小球足细胞密度与足细胞相关蛋白的表达、肾功能、肾纤维化程度有关[9-10]。以上研究均提示足细胞相关分子CD2AP是维持正常肾小球生理功能的重要成分之一。
肾小球足细胞是肾脏的固有细胞，其损伤以后难以修复，也是导致肾病蛋白尿、肾小球硬化以及肾衰竭的重要原因之一[11-13]。临床上通过多靶点治疗可改变肾小球滤过膜分子结构而达到治愈或减轻蛋白尿的目的，延缓肾病肾小球硬化的进程。他克莫司是通过干扰钙依赖性信号传导途径的钙调神经磷酸酶抑制剂，其主要抑制T淋巴细胞的增殖[14]。他克莫司还可通过直接抑制由足细胞钙调神经磷酸酶过度活化介导的细胞骨架分子蛋白synaptopodin的去磷酸化来稳定细胞骨架，进而促进足细胞的修复[15]。本研究通过制备PAN肾病大鼠模型研究他克莫司治疗肾病肾小球硬化的分子机制，结果显示给予他克莫司干预后，PAN肾病大鼠的尿蛋白定量下降，病理改变轻于PAN组。此外，FK组CD2AP蛋白表达较PAN组增强，提示应用他克莫司治疗肾病肾小球硬化，同时可稳定CD2AP分子的蛋白表达。
目前，FSGS的疗效欠佳、病情易反复，是临床治疗难点。本研究显示，足细胞相关分子CD2AP在PAN肾病大鼠中的表达下调，由此推测足细胞分子屏障改变可能是肾小球足细胞损伤的重要指标之一，是临床肾病发生大量蛋白尿的因素之一。他克莫司可能通過稳定足细胞裂孔隔膜分子的结构和功能的完整性减轻肾小球硬化及蛋白尿，并可能通过阻断或修复CD2AP信号传导通路，达到治疗蛋白尿的目的。
参 考 文 献
[1] 曾玉纯，徐安平，付莎， 牛津病理分类方法IgA肾病中的临床应用研究.牛津病理分类方法在IgA肾病中的临床应用研究.新医学，2013，44（10）：689-693.
[2] Lazelle RA， McCully BH， Terker AS， Himmerkus N， Blank-enstein KI， Mutig K， Bleich M， Bachmann S， Yang CL， Ellison DH. Renal deletion of 12 kDa FK506-binding protein attenuates tacrolimus-induced hypertension. J Am Soc Nephrol，2016，27（5）：1456-1464.
[3] Akhtar M， Al Mana H. Molecular basis of proteinuria. Adv Anat Pathol，2004，11（6）：304-309.
[4] 于生友，任琪，于力.肾损伤分子-1对儿童紫癜性肾炎伴急性肾损伤早期诊断的意义. 中华妇幼临床医学杂志， 2016，12（5）：521-524.
[5] Al-Rabadi L， Francis JM， Henderson J， Ghai S. Proliferative glomerulonephritis with monoclonal immunoglobulin in renal allografts. Clin Kidney J，2015，8（6）：722-728.
[6] 李小艳，丁洁，王学晶， 徐国兵，王素霞，冯泉城，姜丽娜.嘌呤霉素氨基核苷大鼠肾病模型与阿霉素大鼠肾病模型的比较.中华肾脏病杂志，2013，29（2）：137-141.
[7] Park HY， Seong SB， Min SY， Ha TS. CD2-associated protein/phosphoinositide 3-kinase signaling has a preventive role in angiotensin II-induced podocyte apoptosis. Int J Biochem Cell Biol，2016，79：370-381.
[8] Adair BD， Altintas MM， Möller CC， Arnaout MA， Reiser J. Structure of the kidney slit diaphragm adapter protein CD2-associated protein as determined with electron microscopy. J Am Soc Nephrol，2014，25（7）：1465-1473.
[9] Beaudreuil S， Lorenzo HK， Elias M， Nnang Obada E， Charpentier B， Durrbach A. Optimal management of primary focal segmental glomerulosclerosis in adults. Int J Nephrol Renovasc Dis，2017，10：97-107.
[10] 于生友，于力，郝志宏，王丽娜，张又祥.他克莫司治疗儿童激素依赖型与耐药型肾病综合征疗效评价. 中国实用儿科杂志， 2013， 28（5）： 366-369.
[11] Fogo AB. Causes and pathogenesis of focal segmental glomer-ulosclerosis. Nat Rev Nephrol，2015，11（2）：76-87.
[12] 张勇军，刘冬，孙永苹， 莫镇涛.雷公藤多甙对糖尿病大鼠尿蛋白、肾小球硬化及足细胞的影响.新医学，2013，44（7）：504-507.
[13] Laskin BL， Jiao J， Baluarte HJ， Amaral S， Furth SL， Akimova T， Hancock WW， Levine MH， Reese PP， Beier UH. The effects of tacrolimus on tcell proliferation are shortlived： a pilot analysis of immune function testing. Transplant Direct，2017，3（8）：e199.
[14] Shengyou Y， Li Y， Zhihong H， Yuanyuan M. Influence of tacrolimus on podocyte injury inducted by angiotensin II. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2015，16（2）：260-266.
[15] Qi XM， Wang J， Xu XX， Li YY， Wu YG. FK506 reduces albuminuria through improving podocyte nephrin and podocin expression in diabetic rats. Inflamm Res，2016，65（2）：103-114.
（收稿日期：2019-03-29）
（本文编辑：林燕薇）
