紫花苜蓿的抗菌肽基因Rev4遗传转化

��y��^=��6�^�����^f�}��w����}�w&���K�i׭�Q-}�Z���"https://www.shanghai-jy.com/k/duizhao/" target="_blank" class="keylink">对照；取1 mL染色液放入2 mL 离心管中，将准备好的叶片浸泡在染液中，抽真空5 min，37 ℃过夜；取出染液，加入800 μL FAA固定液，颠倒混匀，倒掉，重复2次；依次加入30%、75%、95%乙醇，进行脱色，至阴性对照呈黄白色，倒掉95%乙醇，加入FAA固定液；压片后以Nikon荧光体式显微镜观察并采集图像。

1.6.3转化植株的PCR分子检测取149转化的苜蓿叶片，研磨后加入250 μL CTAB提取缓冲液（2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl pH值为8.0，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，3% PVP）和10 μL β-巯基乙醇，65 ℃温浴；加入体积比为25 ∶24 ∶1的酚、三氯甲烷、异戊醇，混匀后 4 ℃、12 000 r/min离心10 min；取上清，无水乙醇醇沉1 h后离心30 min，75%乙醇洗涤沉淀2次；水酶混合液消化RNA；琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR反应为25 μL体系，其中含12.5 μL Premix Ex Taq，正向引物AnF 1 μL，反向引物AnR 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL；PCR程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.6.4PCR产物测序对阳性质粒PCR产物和68个呈阳性的PCR产物进行切胶回收，送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

2结果与分析

2.1转化植株的Gus表达检测

通过GUS组织化学定位法，对根癌农杆菌194菌液侵染的苜蓿组培苗叶片进行GUS瞬时表达检测，转化植株的GUS瞬时表达呈现出蓝色斑点（图1-B），而对照叶片无蓝色斑点（图1-A），初步证明转化体系的成功建立。

2.2转化植株的分子鉴定

本研究利用CTAB法分别提取对照和转化苜蓿组培苗的基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2-A所示，原种与转化种苜蓿基因组DNA都较完整、浓度大、无脱尾。根癌农杆菌菌株149的pKLP36质粒上含有抗菌肽基因，包括烟草中PR-1b部分编码区及抗菌肽基因RIL，长约 200 bp；根据图2-B可知，阳性质粒PCR产物（泳道1）在 100～250 bp 处有条带，紫花苜蓿原种基因组DNA的PCR产物（泳道2）无目标条带，而转化植株基因组DNA的PCR产物有较为清晰的目标条带（泳道3）。

2.3PCR产物测序

对阳性质粒及PCR呈阳性的产物进行回收后测序，发现测序片段与149质粒对比结果一致，信号值基本在正常范围内，即150～500，测序片段质量较高，峰图噪音较低，模板纯度较高。由图3可知，149质粒和13个样品PR-1b编码区部分基因以及抗菌肽基因RIL区段均无突变碱基，即测序成功。

3讨论

3.1利用GUS瞬时表达检测转化体系

Jefferson等首次提出β-葡糖苷酸基因GUS可作为植物遗传转化的报告基因之后，在许多国家都得到了广泛应用，其方法操作简单，灵敏度高，在基因工程领域得到广泛地应用。可以用于瞬时表达检测的报告基因还有绿色荧光蛋白基因（greenfluorescent protein，GFP），但由于有些植物组织中有自发荧光，会影响GFP检测的准确性，产生弱荧光背景，检测弱启动子驱动的GFP活性较难，致使转基因植物的筛选受到限制[10]。GUS酶有产物的放大作用，可以通过GUS染色来进行检测，而未转化植株无GUS活性，因此GUS瞬时表达检测对遗传转化的检测更加简便、可靠[11]。因此，GUS是目前转基因植物中应用最为广泛的报道基因。關于植物叶片的脱色问题，Bowling等通过30%、75%、95%对拟南芥进行脱色，结果对照呈白色，脱色效果好[12]。因此，本试验中脱色步骤借鉴此方法，且脱色效果很好，便于结果观察。

3.2改良的CTAB法提取苜蓿基因组DNA

苜蓿叶片中常含有糖类等物质，使其基因组DNA的提取受限。试验结果表明：经典的CTAB提取缓冲液法最大的优点是能除去多糖，可用于草本植物基因组DNA提取。本研究在传统CTAB法的基础上加入了PVP，可以有效地裂解植物组织细胞，保证核酸完整性。同时，PVP可以与酚类产生络合物，防止多酚对DNA的污染，还可与多糖结合，除去糖类物质。此外，加入抗氧化剂β-巯基乙醇，可有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。利用改良法提取的苜蓿基因组DNA完整性好、亮度高、浓度较大，可满足PCR检测要求。

3.3抗菌肽基因的遗传转化前景

抗菌肽分子较小，动物源抗菌肽在植物体内易被蛋白酶快速降解，成为外原抗菌肽在植物体内表达的限制因素。但在作物中表达动物源与植物源的肽是可能的，可通过消除蛋白酶敏感位点来修饰肽，或設计反向类似物，从而实现对病原抗性的提高[13]。Xing等采用来自异源物种中的肽来抵抗植物病原，研究了来自动物源的肽，筛选了肽对植物蛋白酶的敏感性，结果发现，基于反向序列的肽拥有特别强的对植物叶片中蛋白酶的抵抗能，并同时拥有抗菌活性[14]。本研究以根癌农杆菌介导抗菌肽基因Rev4的遗传转化并获得成功，转化植株作为绿色饲料具有重大的生态和社会效益。

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