摘要：以水稻品种中花 11 号为材料，利用 MAPKK 抑制剂 PD（PD 98059）分析了 MAPK 信号对水稻根系生长、H2O2 产生、生长素积累分布及生长素和细胞周期基因表达谱的影响。结果表明，PD 处理促进了初生根和不定根的伸长生长，但抑制了侧根的形成和发育，并诱导了H2O2 的产生和生长素的积累增加。分子水平分析显示，PD 处理分别使 14 个生长素基因和12 个细胞周期基因表达上调，使 3 个生长素基因和 7 个细胞周期基因表达下调。这些结果说明在正常条件下，MAPK 对水稻幼苗根系生长的调节与其控制 H2O2 产生和生长素平衡及调控生长素和细胞周期基因表达有密切关系。
关键词：MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）；生长素；水稻根系
中图分类号： S511.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0018-04
收稿日期：2013-04-24
基金项目：国家自然科学基金（编号：30671126）；山东省淄博市科技发展计划（编号：109036、111089）。
作者简介：高华健（1992—），男，山东日照人，本科生；任静（1990—），女，山东邹平人，硕士研究生，从事植物逆境分子生物学研究。他们对本工作的贡献相同。
通信作者：赵凤云，教授，从事植物逆境分子生物学研究。E-mail：zfy1226@126.com。MAPK 信号级联是植物体内的重要信号分子[1]，越来越多的证据表明 MAPK 信号在调节植物生长发育、细胞增殖、激素生理及环境胁迫应答过程中发挥重要作用[2]。生长素是植物体内的关键激素之一，影响植物根系生长、细胞分裂及基因表达。关于生长素与 MAPK 的关系有不同的报道[3-4]，如 Mockaitis等报道生长素诱导拟南芥根系 MAPK 活性增加[5]，Mizoguchi 等试验也得到类似结果[6]。相反，Kovtun 等研究表明 NPK1（a specific plant MAPK kinase kinase，MAPKKK）激活 MAPK 信号级联，抑制早期生长素应答基因转录[7]，Lee 等和 Dai 等分别报道 MPK12 和 MKK7 是生长素信号的负调控因子[8-9]。这些研究表明在生长素信号传导过程中存在正调控和负调控 MAPK 途径[4]。
细胞周期是控制植物生长的关键因子之一。MAPK 在细胞分裂过程中起核心作用[4]。如烟草NTF6（Nicotiana tabacum MAPK homolog）在细胞分裂晚后期被激活并瞬时定位在成膜体[10]。NTF4（N. tabacum MAPK homolog）在细胞周期的G1期表达低，但在S、G2期表达高[4]。Ma等报道在胞质分裂过程中MAPK磷酸化与细胞板形成有关[11]。细胞周期进程受细胞周期蛋白和（Cycs）和依赖于周期蛋白激酶（CDKs）等一系列蛋白调控[12]。ROS是植物体内的重要信号分子，有研究表明，MAPK信号途径不仅受ROS诱导，还调节ROS产生[13-14]。这些结果显示MAPK与生长素、细胞周期和 ROS 有密切关系，我们的前期研究发现生长素、细胞周期和 ROS 都参与了水稻根系生长的调节[15]，但是在水稻幼苗根系生长发育过程中 MAPK 与它们的关系还不清楚。本试验以水稻品种中花11号为材料，利用 MAPKK 抑制剂 PD（PD 98059）研究 MAPK 信号对水稻根系生长、H2O2 产生、生长素积累分布及生长素和细胞周期基因表达谱的影响。1材料与方法
1.1材料与处理
以水稻中花 11 号为材料，挑选籽粒饱满的种子去壳后消毒：75% 乙醇（30 s）、0.1% 氯化汞（15 min）、2% 次氯酸钠（20 min），无菌水冲洗 6 次以上，然后将种子分别种在MS 培养基上，置于培养箱内[光周期为 14 h光照，光照强度为 200 μmol/（m2·s），白天温度 26 ℃，夜间10 h温度为20 ℃，空气相对湿度为 50%～60%]培养8 d，然后转入Hoagland营养液添加15 μmol/L PD（PD 98059，MAPKK 抑制剂）处理 5 d，每种处理至少重复3次，每次3个平行试验，每个试验 50～60 株。
1.2根系生长统计
初生根和不定根的长度用尺子测量，初生根和不定根上侧根的数量和长度用带数码相机的显微镜统计和测量，每个指标统计60株。
1. 3H2O2 含量的测定
H2O2的定性和定量测定分别参照Chen等[16]及Loreto等[17]方法进行，每种处理至少用20株。
1.4生长素分布和积累的测定
利用转DR5-GUS 基因水稻对生长素的分布和积累进行测定，方法参照Petersson 等[18]。转基因水稻种子在MS 培养基萌发生长8 d，然后转入Hoagland营养液添加15 μmol/L PD在上述同样条件下分别处理5、10 h，或在Hoagland营养液同时添加0.06% H2O2 和15 mmol/L DMTU（H2O2 清除剂）处理5 h，每种处理至少用20株进行GUS 活性检测。
1.5RT-PCR 分析
使用 Trizol 试剂提取总 mRNA，取1 μg 总 mRNA，利用RNA PCR Kit（AMV）V3.0合成cDNA。每个处理PCR反应用等量的 cDNA，每个泳道用25 μL PCR 产物，每个PCR反应在同样条件下独立重复3次。Osactin1 基因作为内标，通过Gel-Pro Analyzer 软件对基因转录活性进行半定量，将对照的转录水平设置为1，基因表达水平≥1.3为表达上调，≤0.7为表达下调。
1. 6数据处理
用Excel进行原始数据的处理。取3次重复试验的平均值。用单因子方差分析PD处理与对照之间的差异，P<0.05 表示差异显著。
2结果与分析
2.1MAPK对水稻幼苗根系生长的影响
由图1-A，B可见，与对照相比，PD处理促进了初生根和不定根的伸长生长（P<0.05）。相反，该处理条件下侧根的形成和生长受到抑制（P<0.05）（图1-C、D）。说明在正常条件下MAPK 对水稻根系特别是侧根的生长和发育起重要的调节作用。
2.2MAPK对水稻幼苗根系H2O2含量的影响
MAPK对H2O2的产生有调节作用。为了进一步了解MAPK对根系生长的调节是否与H2O2产生有关，定性和定量测定了根系中H2O2的产生。结果显示，在PD处理条件下，H2O2的含量比对照组的增加（P<0.05）（图2-A），定性测定结果与定量测定结果一致（图2-B）。
2.3MAPK对水稻根系生长素积累和分布的影响
生长素是调节根系生长的重要信号分子之一，为了解MAPK调节水稻根系的生长是否与生长素有关，本试验利用转DR5-GUS 基因水稻对PD处理中根系生长素的分布和积累进行了测定（图3）。与对照比，PD处理5 h 和10 h使生长素在初生根根尖各区的积累都明显增加。H2O2 处理5 h 生长素在初生根根尖各区的积累也明显增加，但用H2O2 及其清除剂DMTU 同时处理5 h 后，生长素在成熟区和伸长区的积累减少。这3种处理条件下生长素在不定根根尖各区的积累与分布与初生根的类似。
2.4MAPK对水稻根系生长素基因表达谱的影响
为进一步了解MAPK 与生长素信号的关系，利用RT-PCR 和半定量技术分析了生长素信号途径上的关键基因家族包括OsPINs（生长素运输）、OsARFs、OsIAAs（生长素应答）
表达的变化。图4显示，在PD 处理条件下有17个生长素基因的表达水平发生了明显变化，在这17个基因中只有3个基因（即OsPIN5a、OsPIN9、OsIAA13）的表达下调，其他14个基因（包括OsPIN1b、OsPIN5b、OsARF1、OsIAA2、OsIAA30 等）的表达水平都明显升高，说明在正常条件下前3个基因受MAPK 信号级联正调控，而后14个基因受MAPK 信号级联负调控。PD 处理诱导生长素积累的变化可能与其调节生长素基因表达有密切关系。
2.5MAPK对水稻根系细胞周期基因表达谱的影响
细胞分裂是控制根系生长的重要因素之一，MAPK和生长素都对细胞周期基因表达有调节作用，试验进一步分析了MAPK对细胞周期基因表达的影响。由图5可见，PD 处理使7个细胞周期基因（包括Orysa；CycB2；2、Oryza；CycU2；1、Oryza；CDKC；3、Orysa；CDKE；1、Orysa；CDKG；1、Orysa；CDKG；2、Orysa；CKL2）表达下调，12个基因（包括Orysa；CycA2；1、Orysa；CycB2；1、Orysa；CycD5；1、Oryza；CDKC；1、Oryza；KRP5、Orysa；RB2 等）表达水平上调，说明正常条件下前7个基因受MAPK 信号级联正调控，而后12个基因受MAPK 信号级联负调控。PD 处理诱导根系生长的变化可能与其调节细胞周期基因表达有关。
3讨论
MAPK 信号在调节植物生长发育、细胞增殖、激素生理过程中发挥重要作用[2]。PD 处理抑制 IAA和 ON 诱导的黄瓜不定根形成[19]。本试验结果显示，PD 处理促进了初生根和
不定根的伸长生长，但是抑制了侧根的形成与发育（图1）。生长素影响植物根系生长发育，OsPINs、OsARFs、OsIAAs是生长素信号途径上的关键基因家族[20-22]。研究表明在生长素信号传导过程中存在正调控和负调控 MAPK 信号途径[3-9]。 本试验中，PD 处理使生长素在根尖的积累增加（图3），分子水平分析显示该条件下多数生长素基因表达上调，说明 MAPK 信号途径负调控生长素信号，但是，有 3 个生长素基因的表达下调（图4），暗示 MAPK 信号途径也正调控生长素信号，这可能是因为 MAPK 信号级联不同成员的结合可以调控不同基因的表达。因此 MAPK 与生长素的关系复杂，既有正调控途径也有负调控途径。PD 对根系生长的调节可能与其诱导生长素的增加和调控生长素基因表达有关。试验结果还说明，在正常条件下 MAPK 可能通过调节生长素基因表达控制生长素平衡。
MAPK 在细胞分裂过程中起核心作用[4，6，10-11]。细胞周期进程受细胞周期蛋白等一系列蛋白调控[12]。MAPK 正调控细胞分裂相关基因表达[23]。但是本研究显示，在水稻根系生长发育过程中 MAPK 对细胞周期基因表达的调节既有正调控（如Oryza；CDKC；3 和Orysa；CDKG；2 等）也有负调控（如Orysa；CycA2；1 和Oryza；KRP5等）（图5），PD 对根系生长的调节可能与其调控细胞周期基因表达有关。我们的前期研究表明，ROS 是调节水稻根系生长发育及生长素和细胞周期基因表达的重要信号分子[15]，MAPK 信号调节 ROS 产生[14]，大豆 GmMPK4 基因沉默导致 H2O2 积累增加[23]。本研究中 PD 处理诱导 H2O2 增加（图2），而且 PD 诱导生长素积累的变化与 H2O2 处理的类似（图3），这些结果暗示 MAPK 对根系生长的调节可能还与 H2O2 有关。另外，本试验条件下，只有部分生长素（17个）和细胞周期（19个）基因的表达受 MAPK 信号级联调控，其余基因的表达无明显变化，说明在调节水稻根系生长过程中还存在其他信号途径，如 ROS 信号途径[15]。综上所述，MAPK 信号级联可能通过调节 H2O2 产生和生长素平衡及细胞周期基因的表达参与了水稻根系生长的调控（图6）。
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