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摘要：目的 观察黄芪多糖（APS）在骨髓间充质干细胞（BMSCs）向肿瘤相关成纤维细胞（TAFs）分化中对IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路的影响，探讨其可能的调控机制。方法 以白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导BMSCs，建立向TAFs方向分化的炎性微环境模型;采用CCK-8法分别检测不同浓度IL-6/STAT3通路阻断剂AG490和TNF-α/NF-κB通路阻斷剂BMS345541对BMSCs和诱导后BMSCs增殖能力的影响，Western blot检测阻断剂所对应的靶向蛋白JAK2和IKKβ的表达。将BMSCs分为空白组、模型组、模型+AG490组、模型+BMS345541组、模型+APS组，检测各组TAFs标记分子α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）和IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路关键蛋白STAT3、p65的表达。结果 与空白组比较，模型组BMSCs增殖水平明显增强（P<0.05）;10 μmol/L AG490和5 μmol/L BMS345541较模型组BMSCs抑制作用明显增强（P<0.05）。10 μmol/L AG490对应的靶蛋白JAK2较其他各组表达减弱，5 μmol/L BMS345541对应的靶蛋白IKKβ较其他各组表达减弱，故选为最佳作用浓度。通路阻断剂干预结果表明，与空白组比较，模型组TAFs标记分子α-SMA、FAP和通路关键蛋白STAT3、p65表达均明显升高（P<0.05）;与模型组比较，各干预组TAFs标记分子α-SMA、FAP和通路蛋白STAT3、p65表达均明显下降（P<0.05）。结论 APS对IL-6、TNF-α诱导的BMSCs向TAFs方向分化有抑制作用，其机制可能与调控IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路有关。
关键词：黄芪多糖;骨髓间充质干细胞;肿瘤相关成纤维细胞;IL-6/STAT3通路;TNF-α/NF-κB通路;通路阻断剂
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）10-0054-06
Effects of Astragalus Polysaccharides on Pathways of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB in Process of Differentiation from BMSCs to TAFs
ZHANG Yan-hui， LUO Ya-li， LIU Yong-qi， WANG Lei， XU Xiao-min， FENG Cai-qin， LI Yan
Gansu University of Chinese Medicine， Provincial Key Laboratory of Major Disease Prevention and Control of Molecular Medicine and Traditional Chinese Medicine Research in Gansu Province， Key Laboratory of Dunhuang Medicine and Transformation at Provincial and Ministerial Level， Lanzhou 730000， China
Abstract： Objective To observe the effects of Astragalus polysaccharides （APS） on pathways of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB in the process of differentiation from bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） to tumor-associated fibroblasts （TAFs）; To discuss the possible regulatory mechanism. Methods BMSCs was induced by IL-6 and TNF-α， and an inflammatory microenvironment model which differentiated into TAFs direction was established. CCK-8 method was used to detect the effects of different concentrations of IL-6/STAT3 pathway blocker AG490 and TNF-α/NF-κB pathway blocker BMS345541 on BMSCs and its proliferation after induction. Target protein expressions of JAK2 and IKKβ corresponding to blocker were detected by Western blot. BMSCs were divided into blank group， model group， model+AG490 group， model+BMS345541 group， and model+APS group; expressionsof α-SMA and FAP of TAFs marker molecules and the key proteins of STAT3 and p65 of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB pathway were detected. Results Compared with the blank group， the proliferation ability of the model group increased significantly （P<0.05）; Compared with the model group， 10 μmol/L AG490 and 5 μmol/L BMS345541 had a strong inhibitory effect on the proliferation ability （P<0.05）. The expression of JAK2， a target protein corresponding to 10 μmol/L AG490， was weaker than that of other groups. The target protein IKKβ corresponding to 5 μmol/L BMS345541 was weaker than the other groups， so it was selected as the best concentration. The results of pathway intervening blockers showed that compared with the blank group， the expressions of TAFs makers α-SMA and FAP， and key proteins STAT3 and p65 of pathway in the model group increased significantly （P<0.05）; Compared with model group， the expressions of TAFs makers α-SMA and FAP， and key proteins STAT3 and p65 of pathway in other groups decreased significantly （P<0.05）. Conclusion APS has inhibitory effects on the differentiation of BMSCs into TAFs induced by IL-6 and TNF-α， and its mechanism may be related to the regulation of pathways of IL-6/STAT3 and TNF-α/NF-κB.
Keywords： Astragalus polysaccharides; bone marrow mesenchymal stem cells; tumor-associated fibroblasts; IL-6/STAT3 pathway; TNF-α/NF-κB pathway; pathway blocker
近年來我国恶性肿瘤发病率和死亡率呈上升趋势[1]，因此对肿瘤的防治刻不容缓。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有低免疫原性、多向分化的潜能，有抗肿瘤作用。有研究显示，干细胞微环境异常可使BMSCs发生遗传稳定性的变化甚至分化为肿瘤相关成纤维细胞（tumor- associated fibroblasts，TAFs）[2-3]。在这一过程中，白细胞介素-6（IL-6）介导的STAT3通路[4]和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）介导的核因子-κB（NF-κB）[5]通路可能扮演重要的角色。因此，阻断与TAFs相关的因子或信号通路[6]有望成为应用BMSCs靶向治疗肿瘤的新方式。黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）是黄芪的主要成分之一。本课题组前期研究表明，APS可抑制肺癌微环境中BMSCs增殖的异常改变和维护其所处微环境及自身的稳定[7]。本实验通过阻断与异常分化密切相关的通路，探讨APS对炎性微环境中BMSCs向TAFs方向分化的可能调控机制。
1 实验材料
1.1 药物、细胞和培养
APS（批号ZD1219LA13），上海源叶生物;BMSCs细胞株（编号7500），美国ScienCell公司。将BMSCs用MSCM培养基培养于5%CO2、37 ℃的恒温培养箱中，每2～3 d换液1次。待细胞融合度达80%后，0.25%胰蛋白酶消化传代，第3代细胞用于实验。
1.2 主要试剂与仪器
0.25%胰蛋白酶（批号J170024），Hyclone公司; CCK-8试剂盒（批号170832），上海尚宝生物科技有限公司;人IL-6（批号031316 D1315），PEPRO TECH公司;人TNF-α（批号0607B25 G2516），PEPRO TECH公司;AG490（批号18826），MCE公司;BMS345541（批号8419），MCE公司;兔抗人IKK-β多克隆抗体（批号GR322133-5），Abcam公司;兔抗人JAK2多克隆抗体（批号GR312865-2），Abcam公司;兔抗人GAPDH多克隆抗体（批号AB-P-R001），杭州贤至生物公司;兔抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）多克隆抗体（批号42046），GeneTex公司;兔抗人成纤维细胞活化蛋白（FAP）多克隆抗体（批号YT0845），ImmunoWay公司;兔抗人STAT3多克隆抗体（批号39953），GeneTex公司;兔抗人p65多克隆抗体（批号41556），GeneTex公司;辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（批号B0201），ImmunoWay公司。CO2培养箱（型号MCO-18AIC），日本三洋电机公司;Countstar自动细胞计数仪（型号IC1000），上海睿钰生物科技有限公司;酶标仪（型号IMARK），美国BIO-RAD公司;倒置相差显微镜（型号IX81），日本OLYMPUS公司;凝胶成像分析系统（型号Chemi Doc），美国BIO-RAD公司。
2 实验方法
2.1 分组
将BMSCs分为空白组、模型组、模型+AG490组、模型+BMS345541组、模型+APS组。取第3代状态良好的BMSCs，将细胞浓度调整为1×104个/mL的单细胞悬液，每孔2 mL接种于6孔板内。除空白组外，分别以IL-6 100 ng/mL和TNF-α 50 ng/mL进行干预。每3 d换液1次，每次换液补充新的IL-6和TNF-α，每7 d传代1次，连续诱导42 d后作为模型组细胞用于后续实验。各组细胞倒置相差显微镜镜下观测并采集细胞生长状况。
2.2 CCK-8法检测骨髓间充质干细胞增殖
将融合度约为85%的BMSCs用0.25%胰酶消化后吹打成单细胞悬液，以2×103/孔接种于5个96孔板，置于细胞培养箱中培养，细胞贴壁后加入不同浓度（10、5、2.5 μmol/L）的AG490和BMS345541，每个浓度设4个复孔，分别于24、48、72、96、120 h后每孔加10 μL CCK-8试剂，于酶标仪波长450 nm处检测各组细胞OD值。
2.3 Western blot检测阻断剂靶向蛋白JAK2、IKKβ和成纤维细胞标记分子α-平滑肌肌动蛋白、成纤维细胞活化蛋白及通路蛋白STAT3、p65表达水平
提取各组细胞蛋白，BCA法检测蛋白浓度。各组取10 μL蛋白上样，经5%、12%凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，置于4 ℃冰箱与相应的一抗（1∶1000）相结合，摇床过夜;次日与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗（1∶4000）结合反应，ECL发光显色后，凝胶成像系统曝光检测，采用ImageJ软件对图像进行灰度分析。以GAPDH作内参照，计算各组蛋白的相对表达量。
3 统计学方法
采用SPSS21.0统计软件进行分析。实验数据以x（—）±s表示。组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 不同浓度阻断剂AG490和BMS345541对骨髓间充质干细胞增殖的影响
与空白组比较，不同浓度AG490对BMSCs增殖无明显影响（P>0.05），5、2.5 μmol/L BMS345541对BMSCs增殖无明显影响（P>0.05），而10 μmol/L BMS345541干预后BMSCs的OD值明显下降（P<0.05）。见图1。
与空白组比较，模型组BMSCs增殖水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，10 μmol/L AG490和5 μmol/L BMS345541可使BMSCs增殖水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。因此，选择10 μmol/L AG490和5 μmol/L BMS345541为用于本实验的最佳作用浓度。
4.2 不同浓度阻断剂对骨髓间充质干细胞靶向蛋白JAK2和IKKβ表达的影响
与空白组比较，模型组BMSCs JAK2和IKKβ表达显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，不同浓度阻断剂干预后JAK2和IKKβ蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），且与其浓度呈负相关。结果见图3～图5。
4.3 细胞形态变化
通路阻断剂干预后，空白组BMSCs细胞为梭形，排列整齐，呈旋涡状生长;模型组BMSCs细胞排列紊乱、成团簇状生长;M+A组、M+B组和M+APS组细胞成纤维样，排列分布较均匀。见图6。
4.4 不同浓度阻断剂对肿瘤相关成纤维细胞标记分子α-平滑肌肌动蛋白、成纤维细胞活化蛋白表达的影响
通路阻断剂干预后，与空白组比较，模型组BMSCs TAFs标记分子α-SMA和FAP蛋白表達明显升高（P<0.05）;与模型组比较，通路阻断剂AG490、BMS345541及APS干预后，BMSCs α-SMA和FAP蛋白表达明显降低（P<0.05）。见图7～图9。
4.5 不同浓度阻断剂对骨髓间充质干细胞通路关键蛋白STAT3和p65表达的影响
与空白组比较，模型组BMSCs IL-6/STAT3通路关键蛋白STAT3和TNF-α/NF-κB通路关键蛋白p65表达明显升高（P<0.05）;与模型组比较，通路阻断剂AG490、BMS345541及APS干预后，BMSCs IL-6/STAT3通路关键蛋白STAT3和TNF-α/NF-κB通路关键蛋白p65表达明显降低（P<0.05）。见图10～图12。
5 讨论
基于具有多向分化性及低免疫源性等优点，BMSCs作为治疗肿瘤的生物靶向载体已成为研究热点，但在异常微环境中，BMSCs具有恶性转化的风险，具体机制尚不明[8]。本课题组前期实验显示，干细胞生存的微环境及信号通路的改变可诱导BMSCs向TAFs分化[9]，这提示BMSCs在一定的炎性或肿瘤微环境中难以保全其自身的稳定，可能具有了促瘤或致瘤性[10]。肿瘤间质中活化的成纤维细胞被称作TAFs，又称癌相关成纤维细胞，是肿瘤微环境的重要组成部分，而BMSCs是TAFs的主要来源之一[11-13]，因此在炎性或肿瘤微环境中，阻断BMSCs向TAFs方向分化的路径是维护BMSCs自身稳定性的有效手段，也可能是BMSCs作为靶向载体发挥治疗肿瘤作用的关键点之所在。刘永琦等[14]基于中医学“肾藏精，主骨生髓”理论，认为构成生命原始物质的“先天之精”具有繁衍生殖、生髓化血、化气化神等多元化生性，与BMSCs多向分化的能力具有对应性，故认为干细胞具有先天之精属性，是先天之精在细胞层次的存在形式，BMSCs的分布与“元气”分布也相似[15]。元精、元气皆根于肾，元精在元气推动下，不断濡养形体、脏腑、气血，使五液充，五气治，形体健，营卫调，十二脏化源充足，BMSCs才能维持其自身的稳定性。而在精伤气耗所致肿瘤微环境中，精无所化而失润，气不卫外而失固，十二脏生化无源，导致机体阴阳失衡，进而使细胞信息传导失司，最终BMSCs因内外阴阳的失衡而发生恶性转变。黄芪作为益气之品，其性温可助阳扶正以御外邪，其味甘可培补中气使驱邪之力生化有源，其归经肺脾可益气固表达“阴之使也”守护之功，诸用共奏平衡内外阴阳之效。APS为黄芪的主要成分之一，有调节免疫、抗肿瘤、抗炎、抗病毒及抗氧化等药理作用[16]。
有研究表明，抑制IL-6/STAT3信号通路可减少TAFs介导的细胞增殖[17]。当NF-κB通路处于抑制状态时，TAFs支持肿瘤促血管生成、癌细胞增殖、侵袭等作用被减弱[18]。IKKβ亚基是调节NF-κB活性的主要上游靶点，而BMS345541是IKKβ的高选择性抑制剂。本实验结果显示，10 μmol/L AG490、5 μmol/L BMS345541不仅能发挥明显的阻断作用并对BMSCs的增殖影响最小，且对各自所对应靶蛋白抑制作用最明显。通路阻断剂干预后，两通路中关键蛋白STAT3、p65表达均下降，TAFs标记分子α-SMA、FAP蛋白表达也明显减少。提示BMCSs向TAFs方向的分化与IL-6介导的STAT3通路和TNF-α介导的NF-κB通路有关，并且APS对异常微环境中的BMSCs发挥保护作用可能是通过调控IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路来实现的。
本实验是用IL-6和TNF-α模拟炎性细胞微环境，主要从IL-6和TNF-α介导的经典通路分析BMSCs炎性微环境异常分化机制。但炎性微环境极其复杂，对BMSCs的调控可能涉及多条通路、多种因子等的综合作用。APS发挥作用的具体物质基础尚不明确，有待深入研究和探索。
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