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1.2.4 转基因植株的组织化学染色和GUS酶活定量检测 取4叶期左右的转基因烟草无菌苗，浸入X-Gluc染色液（GBT， St. Louis， USA），置于37 ℃温浴过夜，显色后酒精脱色并拍照。GUS酶活定量检测参照 Jefferson等[10]和Zhu等[11]的方法进行。
2 结果与分析
2.1 野生木薯SuSy1基因5′侧翼序列的克隆与分析
木薯SuSy1基因（cassava4.1_001871m）是其家族在贮藏器官中表达活性最高的成员，根据网站http：//phytozome.jgi.doe.gov中木薯品种AM560基因组草图提供的5′侧翼序列信息设计引物，以野生木薯基因组DNA为模板，PCR扩增获得了约2.1 kb的DNA序列。克隆并测序后，获得野生木薯SuSy1基因ATG上游2 146 bp序列，进一步分析发现，野生木薯SuSy1基因的5′侧翼序列中有1个1 042 bp的前导内含子（Leader Intron， 图1）。启动子区的TATA box，CAAT box等关键元件和其它顺式作用元件的分布详见表2。
2.2 野生木薯SuSy1基因启动子调控区间的筛选
在进行GUS酶活测定前，首先获得了植物总蛋白浓度测定的标准曲线：Ya=20.936Xa-13.285，R2=0.997 9，Ya为蛋白质浓度（mg/mL），和4-MU荧光标准曲线：Yb=0.474 3Xb-64.568，R2=0.999 1，Yb为4-MU的量（nmol）。参考前人的GUS酶活检测方法，对梯度缺失启动子启动GUS基因的活性进行了定量测定，发现在6个梯度缺失载体转化苗中，pE876U1IU2：：GUS和pEU1IU2：：GUS植株的GUS酶活明显高于其它转化植株，由此可知，野生木薯SuSy1基因的前导内含子具有启动活性，可以直接起始基因的转录；-1027至-877区间的151 bp序列对启动子活性有较强的抑制作用；-876至-652区间的225 bp序列可极大地提高启动子的转录活性；SuSy1基因的启动子与前导内含子组合起来的启动活性低于前导内含子单独驱动的启动活性（图2～3）。
2.3 野生木薯SuSy1基因启动子对ABA的响应
转化植株脱落酸（ABA）处理1.5 h后，取上部叶片测定GUS酶活，发现6个梯度缺失载体转化苗中，pE1027U1IU2：：GUS和pE651U1IU2：：GUS植株GUS酶活极显著上调，pE876U1IU2：：GUS、pEU1IU2：：GUS和pE1027：：GUS植株GUS酶活极显著或显著下调（图3）。由此可知，p1027U1IU2与p1027和pU1IU2响应ABA处理的方向相反，p1027U1IU2上调，而p1027和pU1IU2下调；ABA处理条件下，p876U1IU2下调GUS基因的表达，预示-1027至-876区间的151 bp序列正向响应ABA处理，可能存在ABA结合顺式作用元件；p651U1IU2活性上调，而p309U1IU2 ABA处理前后差异不显著，表示-876至-652区间225 bp序列负响应ABA处理，而-651至-310区间的342 bp序列对ABA无明显的响应；p1027和pU1IU2在ABA处理下，启动活性均呈下调趋势，而p1027U1IU2和p651U1IU2上调，说明启动子区的部分序列需要与前导内含子一起形成特定的二级结构才能正向响应ABA，且这部分序列应该是-1027至-876区间和-651至-309区间。
3 讨论与结论
本研究克隆了野生木薯SuSy1基因的5′侧翼序列，发现在其5′UTR区存在1个前导内含子，而且该内含子具有启动活性，可单独起始GUS基因的转录；p876U1IU2启动活性较高，若需要提高SuSy1基因转录活性并保持其组织特异性，可使用p876U1IU2为启动序列。野生木薯SuSy1基因5′侧翼梯度缺失启动子对ABA处理响应明显，可能与启动子中分布有较多ABA响应顺式作用元件有关，如-1027至-877区间存在3个MYB元件，-876至
-652区间存在4个MYB元件和1个W-box，-651至-310区间存在3个MYB元件和2个W-box（表2）。另外，整个启动子区广泛分布根特异表达元件ROOTMOTIFTAPOX1，与SuSy1基因在块根中转录活性高具有一致性[7]。
前导内含子在调控基因转录活性上功能多样，如微管蛋白基因（Ostub16）的前导内含子是维持其高转录活性所必需的[12]，马铃薯SuSy3基因失去前导内含子会导致转录活性丧失，马铃薯SuSy4基因的前导内含子缺失会对该基因的组织特异性和转录活性产生较大影响[13-14]，另有拟南芥COX5c和MHX基因的前导内含子既可提高该基因的转录活性，还可促进基因mRNA翻译为蛋白质[15-16]。本研究中野生木薯SuSy1基因的前导内含子缺失后，对基因转录活性影响不大，但前导内含子自身的启动活性很高，比其他梯度缺失启动子都要高，包括p1027。由此推测，野生木薯SuSy1基因的前导内含子并不是维持基因转录活性所必需的，它的功能可能与环境胁迫和激素处理条件下的基因转录调控相关，主要表现形式可能是启动子中的特定序列可与前导内含子形成特定的二级结构来影响基因的转录，但究竟以何种形式进行转录调控还需进一步研究。
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