石刁柏Ty1—copia反转座子逆转录酶序列克隆及异质性分析

学生物实验园地。采用无激素、化肥栽培方式管理，通过花的结构鉴定性别。石刁柏同属雌雄同株植物文竹（Asparagus setaceus）购自于河南省新乡市农贸花卉市场。

1.1.2 载体与引物 克隆载体为pMD？誖19-T，购自于宝生物工程（大连）有限公司。所用两个反转座子序列引物根据新乡医学院石刁柏基因组高通量测序结果[17]设计，反转座子s101366上游引物序列为5′-GCAATCGTGTTGGTCTAAGT-3′，下游引物序列为5′-CGCCTCTGTAGTTGATAATG-3′，预期长度为635 bp。s107518上游引物序列为5′-TCATTATC- GCTCTGCTCCT-3′，下游引物序列为5′-CTACACA- CCTTCACATTCTC-3′，预期长度为658 bp。引物由北京华大基因研究中心合成。

1.2 方法

1.2.1 石刁柏基因组DNA提取 石刁柏基因组DNA的提取参照文献[18]方法进行改良，分别提取石刁柏2个品种UC309和TD818的雌雄各3个单株基因组DNA。

1.2.2 石刁柏基因组中Ty1-copia反转座子的扩增及分析 PCR的扩增体系均为：25 μL的反应体系中：H2O2 18.9 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL （各2.5 mmol/L），上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol/L），Taq酶 0.1 μL（5 U/μL），1 μL的基因组DNA（约200 ng）。反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性50 s，52 ℃复性 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 35 个循环；72 ℃再延伸 10 min；4 ℃保存。取扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结果用OLYMPUS数码相机在紫外灯下进行观察拍照后参照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）的说明书进行扩增产物回收。感受态细胞的制备、转化、阳性克隆的筛选鉴定参照Sambrook等[19]；样品送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序。

1.2.3 反转座子序列异质性及聚类分析 利用DNAStar软件进行开放阅读框（Open reading frame，ORF）的查找，分析获得序列的反转座子序列特征；利用DNAMAN软件将Ty1-copia反转录转座子序列进行比对，统计并分析序列碱基置换结果；利用MEGA软件构建系统进化树并进行分析。

2 结果与分析

2.1 反转座子s101366和s107518的克隆与测序分析

利用已设计的两对特异引物分别对提取的石刁柏（UC309、TD818）的雌、雄各3个单株及文竹中的基因组DNA共13个模板进行PCR扩增，分别扩增出大小约为635和658 bp的产物，其大小均分别与预期条带大小一致（图1，图2）。

将目的条带分别进行回收测序结果表明，对石刁柏及文竹中的s101366进行扩增并克隆测序，分别获得了52条和3条序列，其中雌株序列27条，雄株序列25条，序列长度范围为630～636 bp；而分别对石刁柏及文竹中的s107518进行扩增并克隆测序，各获得了57条和2条序列，其中雌株序列27条，雄株序列30条，序列长度范围为653～661 bp。

通过NCBI中Blast对所获得的石刁柏的109条序列进行搜索，结果表明，s101366的52条序列中有42条序列包含Ty1-copia反转座子逆转录酶保守区，有10条序列包含RNA酶保守区序列；s107518的57条序列中有51条序列包含Ty1-copia反转座子逆转录酶保守区。因此，进一步证明所获得的两个序列属于Ty1-copia反转座子序列。

2.2 反转座子s101366和s107518异质性分析

利用DNAMAN软件将克隆出的石刁柏52条s101366序列进行多序列比对并统计分析碱基变异（图3），结果表明，序列的一致性为92.44%，该序列中有326个突变位点，有67处发生了单碱基置换，32处发生了双碱基置换，43处发生了多碱基置换，其中共发生了2 082次碱基转换、508次碱基颠换、25个T缺失、86个G缺失和46个A缺失，有80%的碱基置换为转换，20%的碱基置换为颠换。碱基转换中T？圮C占51%，G？圮A占49%。

利用DNAMAN软件将克隆出的石刁柏57条s107518序列进行多序列比对并统计分析碱基变异，结果（图4）发现序列的一致性为92.13%，该序列中有227个突变位点，单碱基置换的有80处，双碱基置换的有35处，多碱基置换的有23处，其中共发生了3 039次碱基转换、760次碱基颠换、6个T缺失、2个G缺失、17个A缺失和23个C缺失，有80%的碱基置换为转换，20%的碱基置换为颠换。碱基转换中T？圮C占51%，G？圮A占49%。结果表明，两个石刁柏反转录转座子序列异质性主要是由于碱基转换（T？圮C）造成的。

2.3 反转座子s101366和s107518序列聚类分析

通过DNAMAN软件对s101366和s107518的序列分别进行多序列比对，其序列一致性分别为92.12%和92.08%。利用MEGA软件对s101366和s107518序列构建进化树（图5、图6），从系统进化树中可以看出，两个反转座子序列各聚类为两个大组。据序列的分布情况可知，反转座子s101366和s107518在石刁柏的品种及的雌、雄株性别之间并未表现出明显的规律性。石刁柏两个品种中的s101366和s107518序列分别与其近缘同属的文竹中的s101366和s107518序列也没有显示出明显差异；文竹的一个单克隆As2和另外两个单克隆As1和As3分别分在了GroupⅠ和GroupⅡ，说明即使同一植物中相同类型的反转录转座子序列也存在一定的差异，且有时种内的异质性差异会大于种属之间。

3 小结与讨论

反转座子具有高度异质性的特征，其异质性主要来源于碱基的缺失、突变、插入和置换，且碱基置换是主要的异质性来源。本研究分析的两个反转座子的异质性也主要是来源于碱基置换，其中，碱基转换的频率要明显高于碱基颠换的频率。早期的研究也表明，不论是核内还是核外的基因，基因突变中转换的频率都要远远超出颠换的频率。而且，一般情况下，转换与颠换的概率比为2∶1，这主要是由于密码子的3个位点所受到的选择压力不同，从而造成突变偏向于密码子的第三位点[20，21]。另外，认为甲基化CG序列是基因突变的一个热点，因为甲基化的C可经过脱氨基的作用转换为T，也提高了碱基转换的频率[22，23]。

本研究对序列的聚类分析结果表明，两个Ty1-copia反转座子在品种、性别、单克隆及近缘种之间的序列均未发现明显的特异性，甚至雌雄同株的近缘种文竹的3个克隆序列也未聚为一组，说明所分析的两个反转录转座子的保守性较强，无论是从雌雄同株向雌雄异株的垂直演化还是不同品种间的横向传递过程中，产生了大量的碱基置换、插入和缺失的变异。但是其变异呈现随机性而均未表现出有规律的变异，这也反映了相同植物类型的反转录转座子保守性较强，同一植物中的相同类型的反转录转座子序列变异比较大，甚至种内异质性差异会大于种间[24]，这种规律是否在石刁柏整个基因组的反转座子中呈现普遍性还需要进一步分析。

参考文献：

[1] YAMPOLSKY C，YAMPOLSKY H. Distribution of sex forms in the phanerogamic flora[J].Bibliotbeca Genet，1966，3：1-62.

[2] RENNER S S，RICKLEFS R E. Dioecy and its correlates in the flowering plants[J].Am J Bot，1995，82：596-606.

[3] KUMAR S，KUMARI R，SHARMA V. Genetics of dioecy and causal sex chromosomes in plants[J].J Genet，2014，93（1）：241-77.

[4] BULL J J.Evolution of Sex Determining Mechanism[M].Menlo Park：Benjamin-Cummings，1983.

[5] 徐 玲，杨 静，刘 林，等.植物反转录转座子的研究进展[J].江西农业学报，2012，24（6）：42-46.

[6] NOMA K，OHTSUBO E，OHTSUBO H. Non-LTR retrotransposons（LINEs） as ubiquitous components of plant genomes[J].Molecular and General Genetics，1999，261（1）：71-79.

[7] YU J，HU S，WANG J，et al. A draft sequence of the rice genome（Oryza sativa L.ssp. indica）[J].Science，2002，296（5565）：79-92.

[8] LING H Q，ZHAO S，LIU D，et al. Draft genome of the wheat A-genome progenitor Triticumurartu[J].Nature，2013，496（7443）： 87-90.

[9] FESCHOTTE C，JIANG N，WESSLER S. Plant transposableelements：Where genetics meets genomics[J].Nat Rev Genet，2002， 3（5）：329-341.

[10] UMEZU K，HIRAOKA M，MORI M，et al. Structural analysis of aberrant chromosomesthat occur spontaneously in diploid Saccharomyces cerevisiae：Retro-transposon Ty1 plays a crucial role in chromosomal rearrangements[J].Genetics，2002，160：97-110.

[11] MORRISH T A，GARCIA-PEREZ J L，STAMATO T D，et al. Endonuclease-independent LINE-1 retrotranspositionatmammaliantelomeres[J].Nature，2007，446：208-212.

[12] 李书粉，李 莎，邓传良，等.转座子在植物XY性染色体起源与演化过程中的作用[J].遗传，2015，37（2）：157-164.

[13] WANG J，NA J K，YU Q，et al. Sequencing papaya X and Yhchromosomes reveals molecular basis of incipient sex chromosome evolution[J].Proc Natl Acad Sci USA，2012，109（34）：13710-13715.

[14] LPTIEN H. Identification of the sex chromosome pair in asparagus（Asparagus officinalis L.）[J].Zeitschriftfür Pflanzenzü- chtung，1979，82：162-173.

[15] DENG C L，QIN R Y，WANG N N，et al. Karyotype of asparagus by physical mapping of 45S and 5S rDNA by FISH[J].J Genet，2012，91（2）：209.

[16] 高武军，张小莉，尹为治.芦笋性染色体的细胞学研究[J].河南农业科学，2008（10）：116-120.

[17] LI S F，GAO W J，ZHAO X P，et al. Analysis of transposable elements in the genome of Asparagus officinalis from high coverage sequence data[J].PLoS One，2014，9（5）：e97189.

[18] 邹喻苹，葛 颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记[M].北京：科学出版社，2001.

[19] SAMBROOK J，FRITSCH EF，MANIATIS T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual[J].NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[20] 丁 波，张亚平.人与大猩猩，黑猩猩和猩猩亲缘关系的探讨[J].遗传学报，1999，26（6）：604-609.

[21] DASSANAYAKE M，OH D H，HAAS J S，et al. The genome of the extremophile crucifer Thellungiella parvula[J].Nature Genetics，2011，43（9）：913-918.

[22] GREENBERG B D，NEWBOLD J E，SUGINO A. Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA[J].Gene，1983，21（1）：33-49.

[23] HORAI S，HAYASAKA K. Intraspecific nucleotide sequence differences in the major non-coding region of human mitochondrial DNA[J].Am J Human Genetics，1990，46（4）：828-834.

[24] STEINHAUER D A，HOLLAND J J. Direct method for quantitation of extreme polymerase error frequencies at selected single base sites in viral RNA[J].J Virology，1986，57（1）：219-228.

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