对照组（A组）、BMSCs组（B组）、硫酸软骨霉素ABC注射组（C组）和硫酸软骨霉素ABC联合BMSCs移植组（D组），每组8只。伤后1～2周采用BBB评分法评价大鼠后肢运动功能，伤后2周取材行HE染色计算损伤区面积，采用免疫荧光染色法观察BMSCs分化为功能性神经细胞的情况。结果：统计分析1～2周后四组大鼠的BBB评分情况，D组大鼠明显高于其余三组，且差异均有统计学意义（P<0.05），但A组、B组、C组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；对比2周后四组大鼠的损伤区面积，D组大鼠损伤区面积明显小于A组，且差异均有统计学意义（P<0.05），A组、B组、
C组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；通过荧光染色后对CSPG区域荧光强度的观察，四组大鼠比较差异均有统计学意义（P<0.05），GFAP/GAP方面D组明显大于A、B、C三组，四组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：采用BMSCs联合硫酸软骨霉素ABC可促进神经纤维再生，对大鼠脊髓损伤修复有一定促进作用。
【关键词】 BMSCs； 硫酸软骨霉素酶ABC； 移植修复； 脊髓损伤
Research on BMSCs Combined with Chondroitinase ABC Transplantation for Spinal Cord Injury in Rats/YU Yun-hu，FU Xiao-hong，YANG Kai-hua，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（11）：031-033
【Abstract】 Objective：To explore the effect of BMSCs combined with chondroitinase ABC（ChABC） transplantation for spinal cord injury in rats.Method：MSCs was isolated and cultured from bone marrow of femur and tibia of neonatal SD rats.The culture of BMSCs was carried out by adherent culture.Rat models of spinal cord injury were prepared.The model rats were randomly divided into the control group（group A），BMSCs group（group B），chondroitin sulfate amphotericin ABC injection group（group C） and chondroitin sulfate amphotericin ABC combined with BMSCs transplantation group（group D）.The number of each group was 8 rats.BBB score was used to evaluate hindlimb motor function after 1-2 weeks，HE staining was used to calculate the damage area after 2 weeks，immunofluorescence staining was used to observe the differentiation of BMSCs into functional neurons.Result：BBB scores of four groups of rats after 1-2 weeks were statistically analyzed.BBB scores of group D were significantly higher than those of the other three groups，and the differences were statistically significant（P<0.05），and there were not significant differences among group A，B，C.The injury area of group D were significantly less than that of group A（P<0.05），and there were no not significant differences among group A，B，C.The fluorescence intensity of CSPG was observed by fluorescence staining，there were significantly between the four group（P<0.05）.GFAP/GAP of group D was significantly higher than those of the other three groups（P<0.05）.Conclusion：The combination of BMSCs and chondroitin sulfate ABC can promote the regeneration of nerve fibers and promote the repair of spinal cord injury in rats.
【Key words】 BMSCs； Chondroitinase ABC； Transplantation repair； Spinal cord injury
First-author’s address：The First People’s Hospital of Zunyi City，Zunyi 563002，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.11.009
脊髓損伤的修复一直是临床的一道难题，脊髓损伤形成的机械性障碍以及其内部化学成分所导致的化学屏障共同阻碍了中枢神经轴突的生长[1-2]。BMSCs取材简便、排异反应不明显，具有多项分化的潜能，是脊髓损伤细胞治疗较为理想的种子细胞[3]。硫酸软骨素酶ABC可特异性降解CSPG，且不破坏其他组织结构，可对BMSCs细胞的分化提供一定的保障[4]。故本实验采用BMSCs联合硫酸软骨霉素移植修复脊髓损伤，观察其对半横断脊髓损伤的修复作用，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 取成年雄性SD大鼠32只，体重200～260 g，利用大鼠T10脊髓半横断模型进行半横断，脊髓损伤模型制备完成后，随机分为对照组（A组）、BMSCs组（B组）、硫酸软骨霉素ABC注射组（C组）和硫酸软骨霉素ABC联合BMSCs移植组（D组），每组8只。伤后采用评分法评价大鼠后肢运动功能，取材进行行染色计算损伤区面积。
1.2 方法 脊髓版横断模型制备完成后，对照组（A进组）不行修复处理；BMSCs组（B组）仅使用BMSCs对大鼠脊髓进行修复处理；硫酸软骨霉素ABC注射组（C组）仅使用硫酸软骨霉素ABC进行修复处理；硫酸软骨霉素ABC联合BMSCs移植组（D组）使用硫酸软骨霉素ABC联合BMSCs进行修复处理。
1.3 观察指标
1.3.1 运动功能 半横断模型制备后观察各组大鼠后肢运动功能情况，并于1～2周后采用BBB评分法对四组大鼠进行运动功能评定。
1.3.2 组织学观察 进行版半横断模型制备后6周过量麻醉处死全部大鼠，以400 mL 4%多聚甲醛灌注后，将以脊髓损伤区为中心的2 cm脊髓全部取出，进行连续矢状切片，片厚20 μm。挑选部分切片进行常规HE染色，染色完成后对四组大鼠的脊髓损伤面积及空洞大小进行观察。
1.3.3 免疫荧光观察 采用免疫荧光染色法对脊髓损伤区进行染色，观察胶质纤维酸性蛋白（硫酸软骨素蛋白多糖）和生长相关蛋白，双标表达情况。
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用F检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 四组大鼠运动功能评估 对比四组大鼠进行脊髓半横断后1～2周的后肢运动功能情况，A、B、C三组大鼠的后肢功能运动情况比较，差异均无统计学意义（P>0.05），D组BBB评分高于其他三组，差异有统计学意义（P <0.05），见表1。
2.2 四组大鼠损伤区面积比较 伤后1～2周，各组大鼠损伤区皆有空洞形成，且A、B、C三组间对比差异均无统计学意义（P>0.05），D组损伤区面积明显小于A、B、C三组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.3 四组大鼠免疫荧光强度值比较 CSPG荧光强度方面A组明显大于B、C、D三组，GFAP/GAP方面D组明显大于A、B、C三组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。
3 讨论
脊髓损伤因受伤位置特殊，其自身的再生修复能力较差，且伤区的化学以及机械性因素导致脊髓损伤病理过程无法选择且不能控制[5-8]。因此有化学性因素导致的继发性脊髓损伤严重影响且决定着预后情况，此过程可施加治疗予以缓解，甚至阻止病程进一步恶化。作为一种较为理想的细胞来源，国内外均有报道BMSCs可在损伤区存活并分化，可移植修复脊髓损伤的实验[9-11]。因此了解脊髓损伤后CSPG的分布变化有助于确定理想的治疗方案，可以更好地辅助BMSCs细胞的分化[12-14]。
本研究发现，T10脊髓半横断模型可较好地模拟脊髓损伤的病理过程，本实验选取大鼠脊髓半横断作为脊髓损伤模型，伤后5 d进行BMSCs细胞移植和硫酸软骨霉素ABC注射，对脊髓损伤后自我形成的化学屏障进行干预。有研究发现，脊髓全横断损伤后，其胶质细胞在损伤区周围组织内增生且形成胶质网状结构，但并未对神经纤维的再生产生完全的机械性阻碍[15-16]。因此机械性损伤并不能阻碍神经细胞的再生，其主要阻碍来自化学屏障方面[17]。在正常脊髓中CSPG的含量较少，因脊髓损伤导致胶质细胞大量增生，其分泌的CSPG增多，重新分化的神经轴突的生长会规避CSPG区域，形成对脊髓神经生长的抑制和诱导[18-20]。本研究通过使用硫酸软骨霉素ABC早期抑制CSPG的产生，降低对神经细胞再生的抑制，从而达到改变神经细胞生长环境以及控制神经细胞再生方向的目的，诱导BMSCs细胞进行分化。通过对四组大鼠损伤区域的比较，2周后D组损伤区面积明显小于对照组的损伤区面积，四组大鼠BBB评分方面，D组大鼠评分高于其他三组，差异均有统计学意义（P<0.05）。通过荧光染色可观察到硫酸软骨霉素ABC、BMSCs注射后免疫强度降低，脊髓损伤后神经结构的修复得到了加强，表明两者联合使用对脊髓损伤的修复有促进作用[21-23]。
脊髓损伤内神经细胞轴突能否再生取决于其抑制与促进间的动态平衡关系。本研究通过使用BMSCs联合硫酸软骨霉素ABC修复脊髓损伤，影响了促进与抑制两方面的作用，对脊髓损伤的修复起到了一定程度上的促进作用。
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