摘 要 “产淀粉酶菌株分离筛选”实验是微生物类重要实验之一，但是常用的碘液显色法需要临时配制显色液，保存期短，而固体碘显色法难以掌握合适的显色程度；改用络合碘显色法，可以清晰地观察到产淀粉酶菌株特征，使用方便、效果稳定。
关键词 产淀粉酶菌株 菌株筛选 显色方法改进
中图分类号：Q642.477 文献标识码：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2017.11.020
Abstract Screening of amylase-producing microorganisms is a key experiment for college micrology course， and in this process， iodine– starch staining was used to identify transparent zone created due to hydrolysis of starch by microbial amylase. When iodine solution was applied as staining agent， it would be prepared， and furthermore， iodine solution just has short storage time. If solid iodine was used， the coloration time was difficult to control. Iodine-containing clathrate can used as starch staining agent， and it is effective and convenient.
Keywords amylase-producing microorganisms； microbial screening method； modification of coloration method
“产淀粉酶菌株分离筛选”实验是微生物综合性实验以及发酵工程实验的重要组成部分。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，在食品、医药、饲料等领域广泛使用，是工业生产和应用领域使用量最大的酶制剂，约占酶市场25%的份额。[1， 2]自1894年第一个工业化淀粉酶来源于真菌以来，微生物淀粉酶已经非常成功地替代了化学方法水解淀粉。[3]
淀粉酶对于工业生产的重要性已经引起了广泛关注，而微生物作为高活性淀粉酶获取的重要资源，促使人们不断地从自然界中筛选新型的高活性的产淀粉酶微生物。[4]利用淀粉平板透明圈法从自然环境中分离筛选淀粉酶生产菌，以淀粉指示剂进行初步判断，可以快速发现淀粉酶产生微生物，目前采用的淀粉显色指示剂是碘液或者固体碘。碘液，组成成分是碘、碘化钾和蒸馏水。碘液显色剂需要自己配制并且保存时间短暂。固体碘利用碘升华法显色，省去了碘液显色法配制溶液的过程，然而不同产酶菌株，对于升华碘的用量、耐受时间及显色时间具有差异，[5]并且不同的培养皿的密封程度差异，也会影响熏蒸过程显色效果。
虽然淀粉酶产生菌筛选研究意义重大，但是淀粉酶活性初筛过程中的显色剂有效期短暂、配制复杂、用量及显色时间等问题制约了该领域的研究工作广泛开展，特别是影响了本科生开设的“产淀粉酶菌株分离筛选实验”的成功率，本研究提供另外一种稳定而使用方便的筛选指示剂，满足快速准确地筛选出产淀粉酶菌株要求。
1 材料与方法
1.1 材料
显色剂：络合碘购自药店（生产厂家：上海利康消毒高科技有限公司）。
产淀粉酶菌株筛选培养基组成（w/v）：2% 可溶性淀粉，0.5% 蛋白胨，0.5% NaCl，0.05% MgSO4 7H2O，0.05% KH2PO4，1.5% 琼脂，pH 7.0-7.2。
100mL小喷壶购自超市（生产厂家：沧县华益塑料制品厂）。
1.2 方法与步骤
从自然环境（土壤和水体）中采集样本，然后放置于灭菌塑料瓶中，立即带回实验室，4℃保存，24h内将采集的样本进行梯度稀释，接种于含有淀粉酶产生菌筛选培养基的培养皿里。设置26℃、30℃、38℃三个温度不同培养箱中培养3-4天，培养皿上长出清晰可见的微生物菌落。
将30-50毫升络合碘装入塑料小喷壶，揭开培养皿上盖，将络合碘快速而均匀地喷雾到长出菌落的淀粉酶产生菌筛选培养基上，静置2-4分钟，观察透明圈的形成，显色时间不能太长（不超过4分钟），以免碘挥发影响观察[注：喷雾到淀粉酶产生菌筛选培养基的络合碘体积为1-2毫升，静置时间为2-4分钟]。
挑取产生透明圈的菌落立即转接至新的淀粉酶产生菌筛选培养基上，培养3-4天，再次显色，用透明圈直径/菌落直径的比值，计算产酶活性[透明圈直径/菌落直径的比值大于1.7的菌落，为产酶活性高的菌落]。将产酶活性高的的菌落划线培养获取单菌落，同时检测各个单菌落的淀粉酶产生情况，筛选产酶活性高的菌落。筛选得到的产酶活性高的淀粉酶产生菌，采用4℃試管斜面和-20℃甘油保存，以备后续研究。
2 结果
2013年6月，从三峡大学欣苑学生食堂附近采集土壤样本和水体样本，立即带回实验室，样本梯度稀释后，涂布于淀粉酶产生菌筛选培养基上，培养3-4天，采用络合碘显色，可以清晰地显示透明圈（图 1）。
通过络合碘显色法，从4个不同样品中获得产淀粉酶微生物情况如表 1。
使用络合碘显色法，能够从所有样品中筛选获得高活性产淀粉酶菌株。土壤A获得的高活性产淀粉酶微生物为11个菌落，都属于细菌。土壤B得到8个高活性菌落，均为细菌。土壤C得到5个高活性菌落，有一个属于丝状真菌。水体样本获得2个高活性细菌。本实验中没有发现培养温度对产淀粉酶菌株筛选有影响，但是显色时间不能太长，否则导致透明圈发生变化影响活性计算。其中土壤B样品中获得了透明圈直径/菌落直径的比值大于4.5的菌落，已经对该菌落进行了分离纯化，继续研究。
通过络合碘显色法，只要拿到合适的样本材料（通常从富含淀粉质的环境采集），完全可以确保每个实验学生获得理想的实验结果，从而减少操作麻烦，提高实验效果，增强学生自信感。
3 讨论
“产淀粉酶菌株分离筛选实验”作为微生物类综合性实验，可以使学生熟悉专用培养基的配制，了解无菌操作的方法及其重要性，本实验的无菌操作往往被学生忽略，导致空气中的杂菌污染，影响产淀粉酶菌株筛选成功几率；学习稀释涂布平板法和划线平板法筛选分离目的微生物，掌握产淀粉酶菌株的筛选分离步骤，认识产淀粉酶菌株的种类及其形态特征。通过本实验的成功与否，可以深化学生对于目的微生物筛选方法重要性认识，同时促使学生了解不同功能微生物筛选样品来源对于实验成败的影响。[6]
“产淀粉酶菌株分离筛选实验”成败受多种因素影响，其中显示剂影响非常明显。碘液中含有的碘是强还原剂，可以被空气中氧氧化，改变碘的存在形态，并且碘易挥发，从而影响作为淀粉显色剂的效果。固体碘熏蒸由于碘用量、毒性等原因，操作比较繁琐而较少被采用。 商品化络合碘使用方便，开瓶即可使用；保质期长达12个月，显示效果稳定。
目前，本科阶段开设的“产淀粉酶菌株分离筛选实验”均采用碘液进行显色，制约了产淀粉酶菌株选出几率。
络合碘采用表面活性剂如：聚醇醚、聚乙二醇、季胺盐等作为碘载体和助溶剂，目前多数国家使用的PVP-I（聚乙烯吡咯烷酮碘，又称聚维酮碘）为基本药物的碘伏。高分子聚合物PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是最好的非离子表面活性剂，性质稳定、无毒、无臭、无味，并且具有很好的缓释效应。PVP凭借氢键与碘分子络合，使得碘的腐蚀性下降，加之PVP的缓释效果，络合碘对产淀粉酶菌株伤害较小，可以直接将显示水解圈的菌株转接而获得高活性产淀粉酶菌株。
4 结语
采用络合碘喷雾的方式筛选产酶微生物，能方便、快捷地筛选产胞外淀粉酶菌株，替代碘液显色法和固体碘熏蒸法推广使用。
参考文献
[1] 胡欣洁，邓斌，胡承.微生物 淀粉酶的研究进展[J].中国品牌与防伪，2005（9）.
[2] 李鹏，王健鑫，罗红宇，戴秋萍.一株产淀粉酶海洋放线菌菌株的选育及发酵条件的研究[J].水产学报，2014（38）.
[3] A. Pandey， P.Nigam，C.R. Soccol， V.T. Soccol， D. Singh， R. Mohan. Advances in microbial amylases[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，2000（31）.
[4] 權淑静，马焕，刘德海，解复红.青藏高原土壤产淀粉酶菌株的分离、鉴定及产酶特性研究[J].河南科学，2015（33）.
[5] 唐嘉，陈朝银，赵声兰，夏静，张涛.一种初筛产胞外淀粉酶菌株的简化方法[J].生物加工过程，2008（6）.
[6] 戴亦军，何伟，袁生，刘中华，贾永，张石柱.研究型模块实验“产淀粉酶菌株的筛选、发酵条件优化、菌种鉴定和选育”的教学实践[J].微生物学通报，2017（44）.
