[摘要] 目的 探讨缺氧条件下乳腺癌细胞γ-分泌酶对Notch信号通路的影响。方法 研究该院于2015年4月—2016年4月期间收治的MCF-7乳腺癌患者，将MCF-7乳腺癌患者细胞分为缺氧Ⅰ组、缺氧Ⅱ组和常规组，常规组加入磷酸盐缓冲液作为对照，缺氧Ⅰ组、缺氧Ⅱ组则分别以50 μmol/L和100 μmol/L浓度的二氧化钴处理，后置于37℃、5%CO2的孵箱中培养24 h。24 h后检测3组样本NICD阳性率，采用Transwell侵袭实验检测并比较3组细胞侵袭能力。结果 常规组、缺氧Ⅰ组和缺氧Ⅱ组MCF-7乳腺癌细胞中NICD阳性率分别为71%、83%和90%，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）；缺氧Ⅱ组（265.62±12.68）MCF-7细胞穿过基质膜的细胞总数最多，缺氧Ⅰ组次之（166.59±11.46），常规组最少（76.72±9.84），组间比较差异有统计学意义（F=165.306，P<0.05）。 结论 缺氧环境下明显提高NICD的阳性表达，缺氧程度越高γ-分泌酶活性越高，Notch信号通路越强，MCF-7细胞侵袭和转移能力越强。
[关键词] 乳腺癌；缺氧；γ-分泌酶；Notch信号通路；影响
[中图分类号] R614 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）06（b）-0026-03
Effect of Gamma Secretase on Notch Signaling Pathway in Human Breast Cancer Cells under Hypoxia
JIANG Hong
Department of Colorectal Anus Surgery， Affiliated Hospital of Binzhou Medical College， Binzhou， Shandong Province， 256600 China
[Abstract] Objective To investigate the effect of γ -secretase on Notch signal pathway in breast cancer cells under hypoxia. Methods The patients with MCF-7 breast cancer admitted and treated in our hospital from April 2015 to April 2016 were selected and divided into three groups， including hypoxia I group， hypoxia II group and routine group， and the routine group added the phosphate buffer for control， and the hypoxia I group and hypoxia II group respectively used the 50 μmol/ L and 100 μmol/ L concentrations of cobalt dioxide for treatment， and were cultured for 24 h in the couveuse at 37℃， 5%CO2， and the positive rate of NICD of the three groups was tested after 24 h， and the invasion capabilities of cells of the three groups were tested and compared by the Transwell invasion experiment. Results The NICD positive rates of breast cancer cells in the routine group， hypoxia I group and hypoxia II group were respectively 71%， 83%， 90%， and the differences between groups were statistically significant（P<0.05）， and the total number of MCF-7 cell through basal plasmamembrane in the hypoxia II group was the most， then the hypoxia I group and routine group， [（ 265.62±12.68） ， （166.59±11.46） ， （76.72±9.84）]， and the difference was statistically significant（F=165.306，P<0.05）. Conclusion The NICD positive expression is obviously improved under hypoxia， and the higher the hypoxia degree， the higher the activity of gamma secretase， and the stronger the Notch signal pathway and MCF-7 cell invasion and metastasis abilities.
[Key words] Breast cancer； Hypoxia； γ-secretase； Notch signal pathway； Effect
乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%，已成为威胁妇女健康的主要病因，并已成为当前社会的重大公共卫生问题[1]。目前，乳腺癌的治疗仍然依靠传统的化疗，其深受频繁的治疗失败和耐药的困扰，因此寻找新的研究靶点、为肿瘤靶向治疗提供新思路无疑具有十分重要的意义。Notch信号途径是一种进化保守的传导信号通路，Notch信号蛋白在多种生物体内均有表达，主要介导细胞的分化抑制信号，是决定细胞命运的信号通路[2]，研究发现，Notch信号通路在乳腺癌的浸润和转移中起着不可或缺的作用[3]。而γ-分泌酶是Notch信号蛋白活化过程中第二步水解的必需酶，与乳腺癌的发生、发展具有密切的关系。此外，低氧肿瘤微环境通过激活基因增加癌症细胞运动和肿瘤细胞外基质降解，从而介导肿瘤的浸润，缺氧可使上皮细胞失去附着功能，并获得能迁徙的间质表型，所以有理由认为缺氧诱导可导致乳腺癌耐药及转移，但其机制尚未完全明确[4]。为进一步探讨缺氧条件下乳腺癌细胞γ-分泌酶对Notch信号通路的影响，进行了该项实验研究，对该院于2015年4月—2016年4月期间收治的MCF-7乳腺癌患者进行分析，以期为乳腺癌治疗提供理论依据，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
乳腺癌MCF-7细胞系（美国ATCC公司）、RPMI 1640细胞培养液（美国Gibco公司）、胎牛血清（美国Gibco公司）、二氧化钴（美国Sigma公司）、4%多聚甲醛固定液（北京Solarbio科技有限公司）、FuGENE HD转染试剂（美国罗氏公司）、Transwell小室（美国康宁生物科技公司）、一抗兔抗人NICD（密理博公司 Millipore，Cat：07-1232，工作浓度1∶100），二抗即用型试剂盒（PV6001、PV9001）及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 MCF-7细胞培养 含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液作为培养基。以4×105个/孔采用6孔板进行接种，常规组加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）作为对照，缺氧Ⅰ组、缺氧Ⅱ组则分别以50 μmol/L和100 μmol/L浓度的二氧化钴处理，后置于37℃、5%CO2的孵箱中培养24 h。24 h后以细胞贴壁融合达80%作为开始传染的标准，传染严格按照试剂使用说明书进行操作，完成后于培养基中孵育10 min。
1.2.2 免疫组化 采用SP二步法免疫组化染色，实验步骤严格按照试剂盒操作说明进行。结果以阳性细胞所占百分比表示，即低倍镜下（40倍）随机选取10个视野，分别计数100个细胞，取均值，以胞核或胞浆呈棕黄、棕褐色为判断阳性标准[5]。无染色或阳性率不足1%以（-）表示，阳性率1%～20%以（+）表示，21%～40%以（++）表示，40%以上以（+++）表示，阳性率≥21%记为阳性表达。
1.2.3 MCF-7侵袭能力实验 将上室未转移的细胞和基质胶去除，切下聚碳酸酯膜，浸入4%多聚甲醛液中固定30 min，PBS溶液清洗3次，常规苏木素染色，中性树胶封片。显微镜（100倍）下计数移至微孔膜下层的细胞。每组样本随机计数5个视野，以穿过基质膜的细胞总数表示乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力，计算出平均值，每组重复试验3次。
1.3 统计方法
采用SPSS 22.0统计学软件分析数据，样本率间比较用χ2检验，计量数据以（x±s）表示，各组细胞穿透基底膜数量比较均采用单因素方差分析（Analysis of single variance，ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 3组样本NICD阳性率比较
结果显示，常规组、缺氧Ⅰ组和缺氧Ⅱ组MCF-7乳腺癌细胞中NICD阳性率分别为71%、83%和90%，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 3组样本MCF-7细胞穿过基质膜的细胞总数
结果显示，缺氧Ⅱ组MCF-7细胞穿过基质膜的细胞总数最多，缺氧Ⅰ組次之，常规组最少，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
3 讨论
研究发现，化疗药物阿霉素和多西紫杉醇在乳腺癌治疗中耐药性的产生在某些情况下可以归因于Notch信号通路与Akt途径的串扰[6]。Notch信号途径是一种进化保守的传导信号通路，Notch信号蛋白在多种生物体内均有表达，其成员的结构具有高度的保守性；并在多种细胞分化、生物发育的过程中发挥着至关重要的作用[7]。Notch信号蛋白主要介导细胞的分化抑制信号，是决定细胞命运的信号通路，同时也是维持干细胞增殖能力的信号通路。Notch信号通路不单影响细胞的分化、发育及凋亡，而且与一些肿瘤的发生、发展相关[8]。Notch的活化是通过启动Notch配体（Jagged/Serrate家族）结合Notch受体（Notch1-4），之后通过TACE和γ-分泌酶相继水解，释放Notch细胞内结构域（NICD）影响核转录。γ-分泌酶是一种包括PS二聚体、Nicastrin、Aph-1、PEN-2 等组分的多酶复合体，是Notch信号蛋白活化过程中第二步水解的必需酶，能够促使受体蛋白胞内段的释放，胞内段进入细胞核后与转录因子CBF-1相结合而产生一系列的生物学效应[9]。
该研究中缺氧Ⅰ组和缺氧Ⅱ组分别以50 μmol/L和100 μmol/L浓度的二氧化钴处理，结果显示，常规组、缺氧Ⅰ组和缺氧Ⅱ组MCF-7乳腺癌细胞中NICD阳性率分别为71%、83%和90%；并且缺氧Ⅱ组MCF-7细胞穿过基质膜的细胞总数最多，缺氧Ⅰ组次之，常规组最少。缺氧Ⅱ组（265.62±12.68）MCF-7细胞穿过基质膜的细胞总数最多，缺氧Ⅰ组次之（166.59±11.46），常规组最少（76.72±9.84），组间差异有统计学意义（F=165.306，P<0.05）国外研究已证实γ-分泌酶抑制剂阻断癌细胞中的Notch信号后，癌细胞的生长受到明显抑制。由于γ-分泌酶在调节NICD释放中起到关键作用，所以，观察缺氧条件下NICD的变化可反映γ-分泌酶的活性，进而反映Notch信号通路的表达状态。同时在，周敏等[10]专家的研究中，证实Notch～4各亚型在A549细胞中均有一定的表达，5、10、20 μmol/L。MW167处理肺腺癌A549细胞2 d后，加药组以及对照组对比，NotchL水平呈现为升高的趋势，组间对比差异有统计学意义（P<0.05）；细胞繁殖率也相应上升（r=0.904）。
综上所述，缺氧环境下明显提高NICD的阳性表达，缺氧程度越高γ-分泌酶活性越高，Notch信号通路越强，MCF-7细胞侵袭和转移能力越强。
[参考文献]
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（收稿日期：2018-03-18）
