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摘要 ：为明确玉米弯孢叶斑病菌的多聚半乳糖醛酸酶基因Clpg1在其致病过程中的作用，采用Double joint PCR技术构建融合片段，利用PEG介导的原生质体转化技术获得18株抗潮霉素突变体，经检测得到1株Clpg1基因敲除突变体ΔClpg1。通过与野生型菌株比较，发现ΔClpg1产孢量和孢子萌发率下降、多聚半乳糖醛酸酶活性降低，致病力减弱。这些结果表明Clpg1基因影响多聚半乳糖醛酸酶活性，调控了玉米弯孢叶斑病菌的致病性。
关键词 ：玉米弯孢叶斑病菌; Clpg1; 基因敲除; 生物学特性; 致病性
中图分类号：
S 432.1
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2018485
Functional verification of polygalacturonase Clpg 1 gene in
Curvularia lunata causing maize Curvalaria leaf spot
CUI Jia1， ZHAO Fengzhou1， LIU Zhen2， QU Jiannan1， LIU Tong2， ZUO Yuhu1
（1. College of Agronomy， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319， China;
2. Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， China）
Abstract
In order to clarify the role of polygalacturonase Clpg1 gene in the pathogenicity of Curvularia lunata， the fusion fragment was constructed using double joint PCR， and 18 hygromycin resistant mutants were obtained by using PEG mediated protoplast transformation technique. A knock out mutant ΔClpg1 which contained no Clpg1 gene was found. Compared with the wild type strain， the sporulation yield and germination rate of ΔClpg1 decreased; the polygalacturonase activity was reduced， and the pathogenicity was weakened. These results indicate that the Clpg1 gene affects the polygalacturonase activity and regulates the pathogenicity of Curvularia lunata.
Key words
Curvularia lunata; Clpg1; gene knockout; biological characteristics; pathogenicity
由新月弯孢Curvularia lunata引起的玉米弯孢叶斑病是一种严重的叶部病害，在我国普遍发生，严重影响玉米产量，有时甚至超过玉米大斑病和黑粉病引起的损失[12]。研究发现，新月弯孢存在明显生理分化和致病性变异[34]。多聚半乳糖醛酸酶（PG）是降解植物果胶骨架结构的主要酶之一，是一類重要的果胶酶[58]。果胶酶在植物病原菌侵染寄主的过程中起重要作用，是病原菌致病因子之一[911]。Jia等通过对辣椒疫霉Phytophthora capsici的毒力和酶活性的试验表明，辣椒疫霉中的多聚半乳糖醛酸酶及果胶裂解酶等的酶活性在致病性中起主要作用，随着发病程度加重酶活性升高[12]。Shieh等[13]对黄曲霉Aspergillus flavus产生的内切多聚半乳糖醛酸酶P2 c进行了研究，发现P2 c有助于黄曲霉对棉铃的侵染和定殖，导致致病性加剧，表明PG参与黄曲霉的致病过程。Roper等[14]则发现糖基水解酶基因家族中pglA基因编码的PG是引起难养木质部小菌Xylella fastidiosa侵染葡萄Vitis vinifera必须的关键致病因子，该基因缺失后X.fastidiosa无法侵染寄主植物。Ten Have等[15]通过对灰葡萄孢Botrytis cinerea的内切半乳糖醛酸酶Bcpg1基因进行基因敲除，发现Bcpg1基因的缺失导致PG的酶含量降低，其致病力显著降低。值得注意的是，当紫麦角菌Claviceps purpurea的两个PG基因Cppg1和Cppg2被敲除后，病菌的致病力几乎丧失[16]。冯晶等[17]将玉米弯孢叶斑病菌分别接种到玉米抗感两个品种上，发现PG在玉米弯孢叶斑病菌侵染过程中可能起重要作用。周舒扬等[18]对玉米弯孢叶斑病菌进行酶活性的测定，发现病原菌可以产生多聚半乳糖醛酸酶等，PG分别在第4天和第10天产生一个峰值，酶活性变化较大，表明PG可能与其致病性相关。
本研究通过构建玉米弯孢叶斑病菌Clpg1基因敲除突变体，分析其对病原菌菌丝生长、分生孢子和附着胞的形态、产孢量和孢子萌发率、多聚半乳糖醛酸酶活性、致病性的影响，旨在明确Clpg1在病菌致病过程中的生物学功能，为进一步解析玉米弯孢叶斑病菌致病分子机制提供理论基础。
