摘 要：猪瘟作为一种烈性接触性传染病严重危害世界养猪业。该病无特效治疗方法，以预防为主。一些国家已经利用我国学者研制的猪瘟兔化弱毒疫苗彻底清除了猪瘟，然而我国却经常出现免疫失败的现象。另外，常规疫苗免疫与野毒感染尚无法区分。因此，新型疫苗的研究显得尤为重要，其中基因工程疫苗成为了研究的热点领域，包括亚单位疫苗、活载体苗、基因缺失疫苗、核酸疫苗等。本文对国内外猪瘟基因工程疫苗的研究进展进行了综述。
关键字：猪瘟；疫苗；基因工程；研究进展
中图分类号：S855.3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2014）11-0072-02
猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever virus，CSFv）引起的，严重危害养猪业的烈性传染病之一，以其流行范围广、病死率高而备受世界各国关注[1]。目前猪瘟主要分布在亚洲、欧洲、南美洲和远东的40个国家和地区[2]。1984年国际OIE组织将其列为A类传染病，现将其归为必须报告的传染病，我国亦将之列为一类动物传染病[3]。我国学者研制的猪瘟免化弱毒疫苗（也称C株）对猪瘟预防有着显著地作用，能有效地预防和清除该疾病。但由于当前猪场免疫计划不科学、不同厂家生产的疫苗质量存在差距、猪瘟疫苗的生产可能存在牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrheavirus，BVDv）的污染及不同毒力野毒株侵袭猪场引起不同的临床症状等原因导致了近年来猪瘟的流行有逐步上升的趋势，常常突然暴发，并以非典型病例为主[4-6]。鉴于常规猪瘟疫苗的生产工艺、无法区分野毒感染等局限性，国内外学者更多地投向了基因工程新型疫苗的研发。常见的基因工程疫苗有亚单位疫苗、活载体苗、基因缺失苗以及核酸疫苗等，现对以上各种新型疫苗的研究进展情况进行简要的概述。
1 基因工程亚单位疫苗
基因工程亚单位疫苗就是应用分子生物学方法从病毒微生物中提取保护性抗原或直接将保护性抗原的编码基因在体外表达，然后将抗原制成亚单位疫苗。这种疫苗不含有酸，当然也不具有感染性，因而非常安全。由于从病原体内所能提取保护性抗原成分十分有限，因此一般采用抗原基因体外表达的方式制备免疫原。杆状病毒-昆虫细胞系统不仅可以高效表达外源蛋白，并且大部分表达的蛋白质都具有较高生化活性，因此该系统常被用于亚单位疫苗研制及生产。Hulst等[7]最早于1993年构建了能够稳定表达CSFv E2蛋白的重组杆状病毒，并用20 μg～l00 μg纯化的E2蛋白制成油包水型疫苗接种试验猪，结果表明免疫组均能抵抗100LD50的猪瘟强毒（Brescia株）的攻击，并且该疫苗诱导产生的中和抗体水平远高于由弱毒疫苗刺激产生的水平。随后，Moormann等[8]、Smit等[9]及Uttenthal等[10]都进行了CSFv E2蛋白的体外表达及免疫效果的研究，结果均表明猪瘟E2蛋白亚单位疫苗可以有效地预防CSFv的感染。也有研究学者利用酵母表达系统制备CSFv的E2蛋白，并将其制备成疫苗后免疫6周龄的仔猪两次，经攻毒实验发现同样可以刺激机体产生抵抗1×105 TCID50剂量的CSFv攻击的中和性抗体[11]。另外，由于该种疫苗刺激机体后仅能产生针对E2蛋白的抗体，并不能促使机体产生除该蛋白以外的抗体，所以给区别疫苗免疫和野毒感染提供了便利条件。目前所建立的区别诊断方法多以CSFv的E0蛋白为抗原，仅有疫苗免疫的猪只不会产生针对E0的抗体，而野毒感染猪则会产生针对E0的抗体，因此该疫苗还是一种标记性疫苗[12]。然而，该种疫苗也有其不足之处，由于免疫原只有一种，与全病毒相比其免疫原性相对较差、产生保护性抗体的时间较长以及产品研发费用较高。CSFv E2亚单位疫苗是最早也是目前唯一投入使用的新型标记性疫苗，其商品化产品为德国Bayer公司的CSF marker和荷兰Intervet公司的Porcilis Pesti。国内尚无商品化的亚单位疫苗，但很多科研单位都在积极地进行研发工作，有些企业则有技术引进的想法，例如新疆天康畜牧生物技术股份有限公司与台湾茂兴生物科技有限公司就猪瘟E2亚单位疫苗授权使用进行协商。
2 基因工程活载体疫苗
2.1 重组活载体疫苗
猪瘟活载体疫苗是将外源目的基因用重组DNA技术克隆到活的载体病毒中制备的一种疫苗，可直接用这种疫苗经多种途径免疫动物。目前研究最多的是痘病毒和伪狂犬病毒，其他作为候选病毒载体还有腺病毒、逆转录病毒等。
痘病毒因其具有较广的宿主谱，较低的毒性，成为了作为生产基因重组疫苗的重要载体之一。Rumenapf等最早将CSFv的E0和E2蛋白的编码序列克隆到痘苗病毒的TK基因后并成功拯救出稳定表达CSFv结构蛋白的重组痘病毒，然后利用该重组病毒免疫试验猪，结果表明免疫后的猪只均能获得攻毒保护[13]。Konig等于1995年发表报道称其研究小组将CSFv的Npro、E0、El和E2编码序列分别克隆到痘苗病毒中，并成功拯救出一系列重组病毒，利用这些重组病毒免疫试验猪后发现只有表达E0和/或E2蛋白的重组病毒才能够使猪只获得攻毒保护，并且证实E2是主要的保护抗原，而E0是次要保护抗原[14]。我国学者李谱华等成功构建了猪瘟E0和E2基因重组鸡痘病毒并取得较好的免疫效果[15]。
猪伪狂犬病毒（PseudoRabies virus，PRv）具有遗传稳定、背景清楚、含有高达40 kb与病毒增殖无关的非必需区可供外源基因插入，使得其成为了一个重要的活病毒表达载体。已证实将CSFv的E2基因序列插入PRv非必须基因内，并不会改变该病毒的生物学特性。van Zjji等最早于1991年发病论文称将CSFv的E1蛋白编码序列插入到PRv构建了减毒活病毒，接种试验猪后能产生针对PRv及CSFv高水平的中和抗体，并能抵抗PRv及CSFv强毒攻击[16]。随后，Peeter等构建了稳定表达CSFv E2蛋白的gD/gE双缺失的重组病毒，并制备疫苗进行免疫攻毒实验，结果表明重组的活载体疫苗能使免疫猪同时产生针对PRv和CSFv攻毒保护的抗体[17]。
除以上两种常用活病毒表达载体以外，还有一些可以进行表达外源蛋白的病毒载体，其中包括腺病毒、逆转录病毒及口疮病毒等。2000年Hammond等构建并拯救了表达CSFv E2蛋白的重组腺病毒，以此病毒免疫猪后能够获得较理想的攻毒保护效果并且攻毒后未出现任何临床症状及剖检病变[18]。我国研究学者孙永科等构建了表达CSFv E0或/和E2蛋白的重组腺病毒载体疫苗并取得较好的免疫效果[19-20]；刘建玲等利用逆转录病毒作为载体并成功获得假病毒，最终利用PK-15细胞表达出E2基因用于疫苗研究[21]。
2.2 复合载体疫苗
复合载体疫苗顾名思义就是将不同的载体的优点整合在一起，使该病毒载体具有更加有效的特性。仇华吉课题组研究者Sun等构建了由人5型复制缺陷型腺病毒载体和高表达效率的甲病毒组成的复合病毒载体，并以此为基础成功获得稳定表达CSFv E2蛋白的腺病毒/甲病毒复合载体疫苗。由于该载体同时具备了腺病毒载体的高效转移外源基因的能力和甲病毒高效表达外源基因及其更强的细胞免疫的能力，使得该载体获得了更有效的免疫刺激反应。实验结果表明，以106 TCID50剂量免疫家兔1次后第9天即可产生猪瘟特异性抗体，并且可持续存在180 d以上。攻毒实验结果证明所有免疫的家兔都能够获得攻毒保护；在猪体以107 TCID50剂量免疫试验猪两次后，即可产生有效的体液免疫和细胞免疫应答，攻毒实验结果证明所有免疫的猪只均能够获得攻毒保护，并且未表现任何临床症状及病理剖检变化[22]。这种将不同载体进行合理化重组的方式能够最大限度的发挥不同载体的优势，给活载体疫苗提供了一种新的思路。
2.3 嵌合型重组病毒疫苗
嵌合型重组病毒疫苗是利用基因技术将目的基因插入并同时替换载体中相应基因而构建的重组病毒。从严格意义上来讲该类疫苗同样可以归为重组活载体疫苗，但其载体主要为CSFv同属的牛传染性腹泻病毒（BVDv）或羊边界病毒（BDv）。2004年Reimann等将CSFv的E2基因替换掉BVDv的E2基因，成功拯救了嵌合型瘟病毒CP7_E2alf[23]。随后，Koenig等用该嵌合型病毒进行免疫试验，结果证实该疫苗安全有效[24]。2010年Reimann等又在此嵌合型病毒的基础上将CP7株BVDv中的E1和E2基因均替换为CSFv对应的基因，构建了另一株嵌合式瘟病毒CP7_E1E2alf_TLA并进行了免疫攻毒实验。结果显示低剂量免疫组猪只仅表现为体温略有升高，并能检测到较低水平的CSFv基因组序列，而高剂量免疫组则表现较好。目前国内虽未有嵌合型猪瘟疫苗的注册与生产，但也有学者进行了相关研究。孙永科等利用反向遗传操作技术，将CSFv强毒石门株基因组不同区域与非典型猪瘟分离株相应区域进行替换，构建了一系列有不同生物学特性的感染性克隆，并以此拯救出了稳定的毒株，为国内标记疫苗的研究踏出了基础性的迈步[25]。
病毒活载体疫苗的本质就是杂合病毒，它同时含有两种甚至多种病毒的基因组信息，并且以载体基因组的转录复制元件介导目的蛋白的转录与翻译，从而能够起到两种甚至多种疾病的同时防控。PRv以其外源基因载量大、表达效率高、对人无害等优点，已逐渐突显出优越的应用前景；痘病毒载体本身可以引起未接种痘苗人群的感染，因而使得痘病毒重组疫苗的应用受到限制；腺病毒可致人感染，潜在的生物安全是限制其作为疫苗载体应用的主要因素。
3 基因缺失疫苗
基因缺失疫苗的核心点就是寻找病毒复制无关但对病毒毒力相关的基因，通过基因工程技术将该基因敲除掉，拯救出这类毒力降低但复制能力并未衰减的毒株。CSFv基因缺失疫苗就是在该种技术下催生出来的新型基因工程疫苗。
Mayer等分别将CSFv Alfort/187中等毒力株和Eystrup株（强毒株）的Npro基因缺失，结果表明拯救的这两株缺失病毒毒力大大降低但其复制能力和母本病毒并无差别。免疫攻毒实验结果证明这两株基因缺失疫苗均能刺激免疫猪产生可以抵抗致死剂量强毒攻击的抗体水平[26]。2006年Frey等利用类似的技术将CSFv的E0基因进行缺失并拯救相关病毒，以此为免疫原接种9周龄仔猪，23 d后进行攻毒试验，同样证实了该类疫苗安全有效[27]。以上数据均显示基因缺失疫苗因其具有几乎所有的CSFv抗原表位，但其毒力有得到了大大的降低，为有目的性地构建弱毒疫苗提供了便利的技术。
4 核酸疫苗
核酸疫苗又称DNA疫苗或基因疫苗，是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗。它是将目的蛋白的编码基因克隆到表达质粒中，然后注入到动物体内，利用宿主细胞表达系统产生目标抗原，进而刺激免疫反应。核酸疫苗与灭活疫苗或亚单位疫苗相比，其不仅能够刺激体液免疫同时可以刺激细胞免疫反应。另外一次免疫后可以产生终身免疫并能有效地解决母源抗体干扰的问题。但该种疫苗也有其特有的问题亟待解决，如：疫苗的生物安全性。
我国学者余兴龙等构建了2个能够表达CSFv E2蛋白真核表达质粒并转染BHK21细胞，利用构建的真核表达质粒在猪体上进行免疫攻毒实验，结果显示只有一种表达质粒能够提供100 %的攻毒保护效果，另一种仅提供了部分保护效果[28]。Ganges等将CSFv E1基因的22个氨基酸残基以及全部的E2基因克隆到真核表达质粒中构建了核酸疫苗并进行猪体免疫攻毒实验。结果表明在最后一次加强免疫后17 d即可以检测T细胞反应，并于攻毒后迅速产生体液反应，能够为免疫猪提供100 %的攻毒保护效果[29]。近来又出现了一种新的核酸疫苗——DNA复制子疫苗。我国学者Li等以甲病毒为载体构建了稳定表达CSFv E2蛋白的新型核酸疫苗质粒，利用该质粒进行免疫攻毒实验，结果表明免疫猪能够产生特异性抗体并可抵挡CSFv强毒的攻击[30]。
5 展望
目前疫苗是预防猪瘟最有效的方法，而猪瘟流行情况的复杂性及临床疾病的非典型性导致了该疾病的预防越来越困难。新型猪瘟疫苗的研究也逐渐成为了当前研究的热点。随着新技术的不断出现，新型猪瘟疫苗的不断改进，尤其是标记性疫苗的发展，肯定能够为养猪业带来更安全有效地防治猪瘟的途径。另外，CSFv的净化也同样急需新型标记疫苗的生产及应用。虽然目前大多数新型猪瘟疫苗的研究仍处于试验阶段，但就目前研究情况来看我们有理由相信不久的将来会有更多安全可靠、使用方便、免疫确实的新型猪瘟疫苗诞生。
参考文献：（30篇，略）
