关键词：代谢组学；中医证候；综述
中图分类号：R2-05 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）12-0110-03
代谢组学是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学[1]，是应用现代分析方法对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有相对低分子质量（通常分子量小于1000）代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。代谢组学的中心任务包括检测、量化和编录生物内源性代谢物质的整体及其变化规律，联系该变化规律与所发生的生物学事件或过程的本质。从定义本身不难看出，代谢组学是将生物体作为一个动态的整体研究其内因或外因导致的代谢变化，这个定义的关键在于其整体性和动态性。这对于揭示复杂性疾病的机理具有独特的优势，与中医学的整体观、系统观和辨证论治思维非常吻合。因此，近年来代谢组学研究方法被越来越多地应用于中医药现代化研究，在中医证候客观化研究中亦有较多尝试。笔者就这方面予以综述。
1 代谢组学的分析方法
1.1 核磁共振波谱技术
核磁共振（NMR）是一种基于具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下，吸收射频辐射而产生能级跃迁的谱学技术。20世纪90年代，Nicholson等[2]于长期研究生物体液的基础上提出了基于NMR方法的代谢组学，是定量研究有机体对由病理生理刺激或遗传变异引起的、与时间相关的多参数代谢应答，其主
要是利用NMR技术和模式识别方法对生物体液和组织进行系统测量和分析，对完整的生物体中随时间改变的代谢物进行动态跟踪检测、定量和分类，然后将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点，进而确定相关的生物标志物[2-3]。NMR检测主要包括氢谱（1H NMR）、碳谱（13C NMR）及磷谱（31P NMR）3种，其中以1H NMR应用最广。与质谱技术相比，NMR的优点主要是：良好的客观性和重现性，便于不同实验室数据的交换和比较；具有无损伤性，前期样品处理简便，不会破坏样品的结构和性质，可以在接近生理条件下进行实验，在一定的温度和缓冲液范围内选择实验条件，可以进行实时和动态的检测，设计多种编辑手段，满足不同实验需求；代谢组中所有代谢物响应系数相同，使得NMR没有偏向性，具有良好的原位定量效果；其信号携带有原子之间的连接关系、动力学性质和相互作用等丰富的分子信息，有利于代谢物的结构鉴定[4]。如1H NMR谱中显示的谱峰与代谢物中氢原子是相对应的，每一个氢原子都会在谱图中得到显示，且谱图中对应氢原子的信号强弱可以反映代谢物中对应化合物的浓度。但NMR的缺点也很明显，主要表现在：灵敏度较质谱低，难以检测到丰度较低的代谢物；对于能检测到的但低含量的代谢物信号较弱，很难检测到共同存在的浓度差极大的代谢物；同一个代谢物有多个信号，有些信号为不同代谢物的信息叠加的结果，即使在二维图谱上也较难区分；NMR所能给出的为结构片段信息，将这些片段进行代谢物归属有一定困难。
1.2 色谱质谱联用技术
利用色谱的分离作用和质谱的鉴定作用能够对代谢物进行准确的定量和快速的定性分析。色谱质谱联用技术包括气质联用、液质联用和毛细管色谱等。气相色谱/质谱（GC-MS）是目前最成熟的联用技术，一般样品经气相色谱（GC）分离为单一组分，按其不同保留时间，与载气同时流出色谱柱，再经接口进入质谱仪，然后可通过电子轰击离子源（EI）或其他方法产生一定的质谱（MS）图谱。GC-MS有较灵敏的分辨率，已经有成熟的商用MS图谱鉴定数据库，可由计算机对MS图谱进行化合物的自动检索匹对，有利于迅速鉴定代谢物。缺点是需要对样品进行衍生化预处理，较费时，且可引起样品性质的改变；衍生化预处理限制了GC-MS的应用范围，无法分析热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。Fiehn[5-6]课题组的一系列有关植物代谢网络的研究比较有代表性，他们用GC-MS对植物拟南芥叶提取物进行了研究，定量分析并确定了其中部分化合物的结构。高效液相色谱质谱联用仪（HPLC-MS）进样前不需进行衍生化处理，适合那些不稳定、不易衍生化、不易挥发和分子量较大的化合物。缺点是分离效率不高，分析的时间相对较长；没有化合物数据库可供检索和比对，成分的鉴别还需进一步的分析。超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱法（UPLC-QTOFMS）是近来用于代谢物分析的一种强有力的方法[7-8]，以其快速的分析速度和精确的MS图谱，同时第一级的四级杆质谱能起到一个预分离和过滤杂质的作用，有利于未知物的结构鉴定，UPLC- QTOFMS将会是代谢组学分析方法的一个重要工具。毛细管色谱（毛细管电色谱）/质谱联用法（CE-MS、CEC-MS）也被用于代谢物的检测[9-10]，Soga等[11]利用CE-MS在尿液中测到1000个以上化合物，说明CEC应用于代谢物测定的潜力也是巨大的。
2 代谢组学的中医证候研究
2.1 核磁共振技术与中医证候研究
2.1.1 动物证候模型 NMR技术应用于动物证候模型的研究对象以单纯证候造模为主。Li等[12]应用质子（1H、13C）NMR波谱法联合主成分分析法（PCA）检测气虚血瘀模型大鼠尿液代谢组变化，发现模型组甲酸盐、肌酐较正常组升高，而α-酮戊二酸、柠檬酸盐、琥珀酸盐和苯酰胺基醋酸盐等多种代谢物较正常组减少。罗氏等[13]应用1H NMR的PCA研究慢性束缚应激大鼠（肝郁脾虚模型）的血浆代谢表型改变情况，正常对照组与模型组相比较，醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3.44 ppm的未知化合物的谱峰峰形改变较为明显。但另一项同样以慢性束缚法证候造模大鼠的NMR代谢组学技术分析得到的代谢物谱结果并不一致，模型组血清中葡萄糖和肌酸的含量明显偏高，而3-羟基丁酸、谷氨酰胺、磷脂酰胆碱、磷酸胆碱和不饱和脂肪酸的含量明显偏低[14]。
另有2项研究应用基于NMR技术的代谢组学方法分析了疾病或生理自然进程中不同阶段证候的代谢谱变化轨迹，为证候的演变物质基础研究提供了思路。刘氏等[15]复制大鼠高脂血症模型，检测造模第2、4、8周血浆1H NMR谱，并进行PCA分析，结果显示，不同时点模型组大鼠的代谢谱亦各不相同，高脂血症前期以脂类代谢紊乱为特点，随着病程进展，参与血液凝固过程的乙酰糖蛋白的出现，说明凝血机制出现异常，同时酮体及乳酸的升高说明脂类代谢紊乱进一步加重，这与同时检测的血脂、血液流变学结果相一致。吴氏等[16]收集4、10、18、24月龄组和补肾中药淫羊藿总黄酮（EF）干预组SD大鼠的尿液进行1H NMR检测，分别采用T检验和趋势过滤法筛选生理性肾虚证的特征性代谢物，同时观察EF对这些代谢物的影响，发现生理性肾虚进程中存在明显的代谢差异，EF能明显改变生理性肾虚进程中的代谢物轨迹。
2.1.2 临床证候研究 应用NMR技术于中医证候的临床研究相对较少，研究对象主要为某一疾病不同证候特征人群。刘氏等[17]应用NMR波谱技术分析银屑病血热证治疗前后及健康志愿者血浆代谢产物谱，通过PCA分析健康人与银屑病血热证患者之间、银屑病血热证患者经凉血解毒汤治疗前后代谢产物谱的差异，发现银屑病血热证患者存在脂类、蛋白质、能量代谢异常及肝肾功能损害。巴吐尔·买买提明等[18]对460例痰瘀证、非痰瘀证肿瘤患者和50名健康人血浆进行1H NMR谱检测，用正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）进行分析，结果发现痰瘀证肿瘤患者可以较好地与健康人和非痰瘀证肿瘤患者代谢物特征进行区分，结果提示，痰瘀证肿瘤患者体内脂肪代谢加强，多种氨基酸下降，细胞抗氧化能力的下降导致细胞膜损伤加重，痰瘀证肿瘤患者体内代谢紊乱程度可能比非痰瘀证肿瘤患者严重。张氏等[19]应用1H NMR联合偏最小二乘判别分析（PLS-DA）可以区分出冠心病心绞痛痰浊证和血瘀证患者的尿液代谢组特征的差异，认为尿液代谢物变化能在一定程度上区分冠心病心绞痛的不同中医证型。
除了挖掘不同证候代谢组特征外，刘氏等[17]所做研究还观察到，以证候相应治疗药物凉血解毒汤干预银屑病血热证患者后，代谢网络呈现向正常状态修复的趋势，提示代谢组学技术不仅可分析证候代谢特征，还可以观察药物干预后代谢网络的修复作用。
2.2 色谱质谱联用技术与中医证候研究
2.2.1 动物证候模型 色谱质谱联用技术应用于中医证候研究尝试较多，常能取得良好的效果。孙氏等[20]用GC-MS技术研究糖尿病肾阴虚证大鼠模型尿液的代谢表型变化，与正常组比较，模型组大鼠尿液中的甘氨酸、琥珀酸含量显著升高，十六烷酸、胆固醇含量显著下降。简氏等[21]用结扎冠状动脉左前降支法复制心血瘀阻证大鼠模型，GC-MS分析养心通脉方干预前后血浆代谢组变化，结果显示，模型组乳酸、丙氨酸、缬氨酸、琥珀酸、苹果酸、硬脂酸、花生四烯酸等代谢物质含量明显增高，果糖含量明显降低，养心通脉方干预后代谢物含量、血液流变学指标均不同程度回调。刘氏等[22]应用UPLC/TOFMS技术分析热证模型大鼠尿液代谢物谱，发现2，4-二硝基苯酚诱导的动物模型随着造模后所处时间段的不同其代谢轮廓呈规律性变化轨迹，认为代谢组学可用于中医证候动物模型的评价研究。
2.2.2 临床证候研究 色谱质谱联用技术应用于临床证候的研究虽然尝试较多，并有一些结果较好的例子，但相对于动物实验难度较大，部分研究未能较好地区分不同证候代谢谱的特征，或不能成功鉴定出差异代谢物。Lu等[23]将原发性高血压辨证分为肝火亢盛、痰湿壅盛及阴虚阳亢3型，应用GC-MS联合PCA、PLS-DA和马氏距离（MD）等数据分析法分析健康人及原发性高血压病患者血清代谢谱，发现健康人与高血压病患者血清代谢谱有明显差异，但PCA和PLS-DA不能将中医高血压的3型完全分开，而利用MD不仅可以清晰地区分上述3种类型的高血压，同时还可显示高血压的发展程度。郑氏等[24]以GC-MS联用结合PCA和OPLS-DA模式识别为主的代谢组学方法分析慢性心力衰竭患者54例（其中肾阳虚证27例、非肾阳虚证27例）及正常人24例的尿液代谢谱变化，可区分肾阳虚和非肾阳虚两组患者，但未能鉴定得到差异代谢物。
3 小结
从目前代谢组学在中医证候研究取得的成果可以看出，代谢组学在分析复杂的中医证候特征上有一定的效果，已初步显示出不同证候特征类型群体间代谢谱的差异，部分研究尝试建立诊断模型来判别证候。但目前研究也还存在一些问题，主要是两个方面。①代谢组分析方法和采样单一：上述研究基本采用一种代谢组学分析方法分析一种体液样本，未见应用多种分析方法、多种体液验证比较。
实际上，任何一种代谢组学分析方法在单一样本中得到的代谢物谱都是局限于一定层面的，多种分析方法、多种样本结合分析可能使得到的代谢物特征更趋近全貌。②研究中影响分析结果的干扰因素太多。
纵观上述研究，尤其是临床样本的研究，除了性别、年龄等一般因素可能影响代谢物差异外，较多研究结果中代谢物差异不能排除来源于疾病与健康者之间的差异或者疾病程度轻重之间的差异，甚至可能夹杂着不同疾病之间的差异，可能与证候的特征相距甚远；另外，样本量的不足也可导致组间差异出现偏倚。因此，今后研究需要重视组间除证候以外其他特征的平衡性，需要排除更多的干扰因素，设计更严谨的分组，保证一定的样本量，并尝试更多的分析方法，以取得准确可靠的结果，为实现中医证候的客观化提供依据。
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