[摘要]以绿原酸、木犀草苷含量，液相指纹图谱相似度为评价指标，考察自然晒干、烘房烘干、微波杀青烘干、滚筒杀青烘干、硫磺熏蒸阴干5种不同产地加工方法对江苏省东海县药材种植基地金银花质量的影响。结果表明不同产地加工方法对金银花药材中绿原酸含量、液相指纹图谱相似度有显著影响，对木犀草苷含量无明显差异。微波杀青烘干、滚筒杀青烘干样品绿原酸含量较高，分别为3.67%，3.39%，液相指纹图谱相似度分别为0.815，0.793；烘房烘干、硫磺熏蒸阴干样品绿原酸质量分数分别为2.87%，2.53%，液相指纹图谱相似度分别为0.964，0.765；晒干样品绿原酸质量分数最低为1.92%，液相指纹图谱相似度为0.940。根据研究结果，同时结合江苏康缘药业股份有限公司金银花药材内控标准，东海县种植基地金银花最佳加工方法为烘房烘干法，该研究为江苏省东海县药材基地金银花产地加工方法的确定提供了理论依据。
[关键词]江苏省东海县；金银花；产地加工方法；绿原酸；木犀草苷；液相指纹图谱相似度
金银花Lonicerae Japonicae Flos为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]，具有清热解毒、疏散风热之功效[2]。传统上以河南封丘县、山东平邑县为道地产区[3]。金银花主要含有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、环烯醚萜苷类和挥发油类等化学成分[4-6]；具有抗炎、抗菌、解热、抗病毒、抗内毒素、抗真菌、降压保肝利胆、免疫调节等作用[7-8]。
江苏康缘药业股份有限公司为保证热毒宁注射液质量稳定性，提升产品安全性，在江苏省东海县建立了万亩金银花种植基地，所种植金银花经中国中医科学院中药资源中心黄璐琦研究员鉴定确认为忍冬科忍冬属植物忍冬L. japonica。采收期、加工方法、贮藏等过程都有可能导致金银花药材质量下降，其中，药材产地加工干燥是控制药材质量的重要环节[9]。目前，金银花的产地加工方法主要有以下4种：自然晒干、烘房烘干、微波杀青烘干、滚筒杀青烘干。传统的自然晒干方法，其指标性成分绿原酸的含量受采收加工期的天气条件影响波动较大。为了减少气候因素对金银花品质的影响，种植规模较大的农户多已采用烘房烘干，既保证了质量，也缩短了干燥时间[10]。采用杀青烘干干燥法能够快速杀死多氧化酶，绿原酸的含量较高[9]。滚筒杀青机杀青后烘干的原理是利用高温快速杀酶，后2种加工方法在部分种植区已有应用。
本文采用不同干燥方法对江苏省东海县种植基地金银花药材进行产地加工方法研究，结合热毒宁注射液药材内控标准及基地规范法种植需求，确定最佳的产地干燥加工方法，为江苏省东海县种植基地金银花干燥方法的确定提供理论依据。
1材料
高效液相色谱仪Agilent 1100（美国安捷伦公司）；LK-200A 100g手提式高速中药粉碎机（浙江温岭市创立药材仪器厂）；数显恒温水浴锅HH-4（国华电器有限公司）；微波杀青机（南京博有微波）；滚筒杀青机（山东省营南壮岗继宏茶叶机械厂）；烘房（江苏康缘药业股份有限公司自建）。
绿原酸，木犀草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为110753-200413，111720-200501）；乙腈为（色谱纯，Tedia company）；甲醇（分析纯，南京化学试剂有限公司）；冰醋酸（分析纯，南京化学试剂有限公司），水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1样品处理
采收江苏省东海县种植基地同一种植田二白期金银花鲜花25.0 kg，混合均匀，均分为5等份，分别采用自然晒干、烘房烘干、滚筒杀青、微波杀青、硫磺熏蒸5种产地加工方法获得金银花干花；5种加工方法干燥温度及时间是实际干燥操作过程的监控数据，参数设置参考多篇文献及预实验的结果后设计的。本实验在相同地块重复进行10次，含量测定与液相指纹试验结果取10次实验平均值。
2.1.1自然晒干样品 取鲜花平铺于长1.5 m，宽0.5 m的芦苇席上，平铺厚度约0.3 cm，于10：00放于阳光充足的地方晾晒，晾晒过程不翻动，17：30收于房间中，如此连续，于第4次下午14：30收样，日晒时间共27 h，日晒时天气晴朗，正午温度26～28 ℃，湿度65%～75%，样品标记为晒干样品S1。
2.1.2烘房烘干样品 取鲜花平铺于长1.5 m，宽0.8 m的筛网中，平铺厚度约0.3 cm，放于东海基地自建烘房烘干，温度控制为30～35 ℃烘烤1 h，40～45 ℃烘烤7 h，60～65 ℃烘烤8 h，烘干时间共16 h，得到烘房烘干样品S2。
2.1.3微波杀青烘干 取鲜花，摊于传输带上，进入杀青机，进行微波杀青，鲜花经过设备主体部分时间为90～100 s，微波杀青后出口花温度为90～95 ℃，杀青后花平铺于筛网，平铺厚度约0.3 cm，放于自建烘房中烘干，烘干的温度为1 h内，温度由室温升至50 ℃，50～60 ℃保持3 h，70 ℃保持2 h，干燥时间共约6 h，得到微波杀青烘干样品S3。
2.1.4滚筒杀青烘干 当杀青机表面温度达到290 ℃时，保持稳定，取鲜花均匀加入到杀青机中，鲜花杀青时间为85～90 s，出口鲜花温度为90～95 ℃，滚筒杀青后的鲜花平铺于筛网上，平铺厚度约0.3 cm，进烘房烘干，烘干的温度为1 h内，温度由室温升至50 ℃，保持50～60 ℃ 3 h，70 ℃保持2 h，停风机，停炉，干燥时间共约6 h，得到滚筒杀青烘干样品S4。
2.1.5硫磺熏蒸阴干 取鲜花平铺于熏蒸框筛网上，硫磺置于框底，晒网上用塑料密封，点燃硫磺进行熏蒸，熏蒸时间约12 h，熏蒸后药材阴干，阴干时间47 h，得到硫磺熏蒸阴干样品S5。
2.2绿原酸、木犀草苷含量测定[2]
2.2.1绿原酸测定色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87）为流动相；检测波长327 nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1 000。
2.2.2木犀草苷测定色谱条件与系统适用性试验 以苯基硅烷键合硅胶为填充剂（Agilent ZORBAX SB-phenyl，4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-0.5%冰醋酸溶液（B），梯度洗脱，0～15 min，10%～20% A；15～30 min，20% A；30～40 min，20%～30% A。检测波长350 nm。理论板数按木犀草苷峰计算应不低于20 000。色谱图见图1，2。
2.3金银花药材指纹图谱测定方法
2.3.1参照物溶液的制备 金银花中主要有效成分为绿原酸，在金银花药材指纹图谱中，绿原酸峰面积百分比贡献最大，且检测数据稳定，所以选择绿原酸作为参照物。
2.3.2供试品溶液的制备 通过提取溶媒考察结果，为了更全面控制金银花药材质量，选择50%甲醇作为提取溶剂，超声30 min提取的提取方法，该方法经过验证，能够较完全地提取金银花中主要成分。方法为：取金银花药材粉末（过4号筛）0.2 g，置50 mL锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定，超声（250 W，35 kHz）提取30 min，放冷，再称定，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.3检测方法 Agilent 1100 液相色谱；MWD多波长紫外-可见检测器，G1313A 全自动进样器，Agilent LC色谱工作站。Phenomenex luna C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱0～50 min，20%～60%甲醇；50～60 min，60%甲醇。检测波长225 nm；柱温30 ℃；流速1 mL·min-1。
2.3.4测定波长 根据供试品溶液紫外光谱，共选择在270，225，245，300，327 nm等5个波长下检测，其中，绿原酸最大吸收波长327 nm，但在该波长下，其他指纹峰都较小，经过对比分析，在225 nm波长的色谱图中各指纹峰峰面积比较平均，绿原酸峰面积适当，且较稳定，故选定检测波长225 nm。延长测试时间1倍至2 h，未见滞后峰出现。
2.3.5稳定性试验 取同一批金银花药材供试品溶液，隔3 h测1次，共测6次，计算相似度均不小于0.98，表明供试品溶液15 h内成分是稳定的，符合指纹图谱的技术要求（不小于0.95）。
2.3.6精密度试验 同一批金银花药材供试品溶液连续进样6次进行测定。各共有峰的保留时间及主要峰（占总峰面积3%以上）的峰面积基本一致（RSD<3.0%），再以第1次进样所得指纹图谱作为对照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度均不小于0.99，均符合指纹图谱的技术要求。
2.3.7金银花药材标准指纹图谱的确定 采购道地产地山东平邑金银花药材10批、河南封丘金银花药材10批、江苏东海7批（经过鉴定为忍冬科植物忍冬L. japonica的干燥花蕾），共27批样品用于构建金银花药材标准指纹图谱。根据《中药指纹图谱研究的技术要求》，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价软件，将27批次金银花图谱数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件B 版》，匹配后图谱见图3。
2.4金银花中绿原酸、木犀草苷含量测定及液相指纹图谱相似度结果分析
按2.2，2.3项下绿原酸、木犀草苷含量及液相指纹图谱检测方法对27个批次样品进行测定。绿原酸、木犀草苷含量以干燥品计算，结果见表1。
5种加工方法所得金银花药材液相指纹图谱见图5。把每种加工方法得到27批样品分别进行测定，将27批次金银花图谱数据导入《中药指纹图谱相似度计算软件B 版》，获得 “共有模式指纹图谱”作为该种加工方法的标准指纹图谱，分别命名为S1，S2，S3，S4，S5；再与2.3.7项形成的金银花标准指纹图谱进行相似度计算，结果见表1。
2.5样品性状
5种样品性状有明显不同，自然晒干样品色黄白，花体呈自然弯曲状，蓬松；烘房烘干样品色黄白略带青色，花体呈不自然弯曲，扁瘦；微波杀青与滚筒杀青样品色青绿美观，花体较直，见图6。
3讨论
为了保证热毒宁注射液中金银花药材质量可控，江苏康缘药业股份有限公司建立金银花药材基地。江苏省连云港市东海县海拔27 m，地属黄淮海平原东南边缘的平原岗岭地，气候属暖温带湿润季风气候，日照充足，雨热同季，四季分明，全年无霜期达225 d，年平均日照2 394 h，年平均降水913 mm，且东海县位于江苏省北部，邻接山东省临沂市，距离金银花道地产区平邑县190 km，根据《中药资源学》记载，属于道地产区划分范围内，而且中国医学科学院药用植物研究所的研究表明，基地所在地的生态适宜性与道地产区山东相似度为95%以上，适宜金银花生长。热毒宁注射液新药研究阶段使用的金银花药材为山东的道地药材，故选择江苏省东海县为金银花规范化种植基地。
采用微波杀青方法和滚筒杀青方法得到的金银花药材液相指纹图谱与其他方法由较大差异，2种方法的液相指纹图谱与金银花药材标准指纹图谱比较，保留时间为14.826 min的色谱峰（绿原酸）含量比保留时间为16.509 min与17.66 min的色谱峰峰面积明显变小，保留时间25.235 min的色谱峰峰面积明显增高，导致杀青的2种方法液相指纹图谱相似度在0.85以下。针对微波杀青及滚筒杀青上述指纹图谱的变化情况，专门成立项目组对保留时间25.235 min的色谱峰进行分离及鉴定，确定该成分为裂环马钱素，因其结构上含有一个不稳定的醛基，可控性较差，项目组目前正在对裂环马钱素的药理活性进行深入研究。
由于金银花加工过程受热程度及干燥时间不同，绿原酸含量、液相指纹图谱、药材性状有明显差异。传统的自然晒干样品虽然液相指纹图谱相似度大于0.9，但绿原酸及木犀草苷含量最低，且干花色泽较差，同时考虑晒干方法受自然条件影响较大，过程可控性差，不适合大规模种植基地使用。硫磺熏蒸阴干样品绿原酸及木犀草苷含量与烘房烘干法比较接近，但硫磺熏蒸样品指纹图谱在绿原酸峰前有个明显的高峰，其他干燥方法及对照中均未出现，分析原因可能是硫磺熏蒸样品中存有硫残留。2种杀青方法得到的药材绿原酸含量较高，但考虑杀青干燥制备过程中产生了可控性较差的成分，为了保证东海基地金银花药材与热毒宁注射液研究阶段使用药材的一致性，烘房烘干法得到的金银花样品绿原酸、木犀草苷含量、液相指纹图谱相似度均符合要求，故确定为江苏东海规范法种植基地金银花药材最佳的加工方法。
[参考文献]
[1] 梅全喜，毕焕新.现代中药理手册.第1卷[M].北京：中国中医药出版社，1998：96.
[2] 中国药典.一部[S].2010：205.
[3] 吕患成，吕召.药用忍冬属植物的地理分布及其开发建议[J].松辽学刊：自然科学版，1997（3）： 20.
[4] 吴晓春，杨苏亚.金银花的成分及药理作用分析[J].青海医药杂志，2007，37（5）：88.
[5] 李娜，阮文辉.金银花成分分析研究进展[J].科技情报开发与经济，2011，21（18） ： 178.
[6] 王燕， 王智民，林丽美，等.金银花及其同属植物化学成分研究进展[J].中国中药杂志，2008，33（8） ： 968.
[7] 石钺，石任兵，陆蕴如.我国药用金银花资源化学成分及药理研究进展[J].中国药学杂志，1999，34（11） ：724.
[8] 赵国玲，刘佳佳，林丹.金银花化学成分及药理研究进展[J].中成药，2002，24（12） ：973.
[9] 宋健， 张会敏， 石俊英.金银花最佳产地加工方法杀青烘干干燥法[J].中药材，2008，21（4） ：489.
[10] 高晓艳，凌娅，萧伟.不同产地加工方法的金银花中绿原酸、木犀草苷含量及指纹图谱比较[J]. 世界科学技术——中医药现代，2010，12（ 2） ：291.
Influence of different processing methods on Lonicerae Japonicae Flos from
Donghai cultivation base in Jiangsu province
WANG Yong-xiang1， 2， LUO Yong1， SHEN Juan 1， 2， ZHOU Yi-fei1，2， WANG Zheng-zhong1， 2， XIAO Wei1，2*
（1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process， Lianyungang 222001， China）
[Abstract] To study the impact of five different origin processing methods， namely natural drying， drying in baking shop， drying by microwave heating， drying in drum and drying with sulphur fumigation， on the quality of Lonicerae Japonicae Flos from Donghai cultivation base in Jiangsu Province， with the contents of chlorogenic acid and galuteolin and the similarity in HPLC fingerprints as the evaluation indicators. The results showed that different origin processing methods had significant impact on the content of chlorogenic acid and the similarity in HPLC fingerprints， but with no significant difference on the content of galuteolin. By means of drying by microwave heating and drying in drum， the samples showed higher contents of chlorogenic acid， respectively 3.67% and 3.39%. The similarities of HPLC fingerprints were 0.815 and 0.793， respectively. By means of the drying in baking shop and the drying with sulphur fumigation， the contents of chlorogenic acid in the samples were 2.87% and 2.53%， respectively. The similarities of HPLC fingerprints were 0.964 and 0.765， respectively. The lowest content of chlorogenic acid in naturally dried samples was 1.92%. The similarity of HPLC fingerprints was 0.940. According to the findings as well as the internal control standards for Lonicerae Japonicae Flos herbs of Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.， Ltd.， the optimum processing method for Lonicerae Japonicae Flos from Donghai cultivation base was the drying in baking shop. This study provided a theoretical basis for determining the processing method for Lonicerae Japonicae Flos from Donghai cultivation base of Jiangsu Province.
[Key words] Donghai county of Jiangsu province； Lonicerae Japonicae Flos； origin processing method； chlorogenic acid； mignonette； similarity of HPLC fingerprints
doi：10.4268/cjcmm20141414
[责任编辑 马超一]
