摘要 [目的]从实验室保藏的乳酸菌中筛选出耐酸耐胆盐能力较强的乳酸菌，并研究其对肠上皮细胞的黏附能力及对肠道病原菌的抑制能力。[方法]通过模拟人工胃肠液及体外与IEC-6细胞共培养来分别研究乳酸菌的耐酸耐胆盐能力及对细胞的黏附能力，并利用单层琼脂平板扩散法测定其抑菌效果。[结果]试验的27株乳酸菌中，10株乳酸菌在pH 3.0的人工模拟胃液中培养3 h的存活率均大于44.00%，在pH 8.0的人工模拟肠液中培养4 h的存活率均大于51.56%，在含0.30%胆盐的培养基中培养24 h的存活率均大20.00%；其中菌株C13、A03、A17及A90对IEC-6细胞的黏附个数均大于8个/cell；菌株C13、A03对艰难梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌的抑制能力较强，抑菌圈直径均大于22 mm。经16S rRNA测序将C13 和A03分别鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosu）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。[结论] L.rhamnosu C13、L.plantarum A03的耐酸耐胆盐能力及对上皮细胞的黏附能力较强，对肠道病原菌有较好的抑制作用，可作为良好的抑制肠道病原菌的候选益生菌株。
关键词 乳酸菌；耐酸耐胆盐；黏附；抑菌
中图分类号 TS252.1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）34-0078-03
Abstract [Objective] Lactic acid bacteria （LAB） with strong resistance of acid and bile salt were screened from laboratory，and their adhesion ability of intestinal epithelial cells and inhibition ability to intestinal pathogens were studied.[Method]The resistance of acid and bile salt and the adhesion ability of IEC6 cells were studied by artificial gastrointestinal fluid and cocultured with IEC6 cells，respectively，and the bacteriostatic effect was deter mined by single agar plate diffusion method.[Result]The survival rate of 10 strains were cultured 3 h in pH 3.0 artificial gastric juice was greater than 44.00%，and cultured 4h in pH 8.0 artificial intestinal juice was greater than 51.56%，and cultured 24 h in medium containing 0.30% bile salts was greater than 20.00%； the adhesion number of C13，A03，A17 and A90 on IEC6 cells was greater than 8 cells； the inhibiting capacity of C13，A03 on Clostridium difficile，Salmonella and Escherichia coli was stronger than others，the antibacterial circle diameter was greater than 22 mm.C13 and A03 were identified as Lactobacillus rhamnosu and Lactobacillus plantarum by 16S rRNA sequencing，respectively.[Conclusion]L.rhamnosu C13，L.plantarum A03 with the strong ability of acid and bile salt resistance and adhesion to epithelial cells，which have good inhibitory effect on pathogenic bacteria，and can be used as a fit probiotic candidate strain.
Key words Lactic acid bacteria； Resistance of acid and bile salt； Adhesion； Inhibition of pathogenic bacteria
腸道菌群在维持机体的健康过程中发挥着重要的作用，与人体的消化营养、免疫代谢、生物拮抗等密切相关[1]。抗生素由于见效快、针对性强等特点被大量用于疾病的治疗，而其过度使用导致了肠道菌群的紊乱，引起了艰难梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌等肠道致病菌的繁殖，进而引发机体腹泻、呕吐、酸中毒等症状，同时也会导致机体易感染情况增加，引起二重感染，降低其免疫功能，对机体的健康产生了严重的影响[2-3]。
乳酸菌作为人体肠道中的重要有益微生物，可以通过产生短链脂肪酸、乳酸、甲酸、细菌素、过氧化氢及小分子肽类等一系列代谢产物来拮抗肠道致病菌[4]；同时乳酸菌通过其表面的黏附素与肠黏膜细胞紧密结合，形成生理屏障，并通过与致病菌竞争肠道上皮细胞的黏附位点、生存空间及营养物质来抑制肠道病原菌的生长[5]，改善肠道菌群紊乱的状况，达到改善肠道微环境的效果。乳酸菌作为益生菌必须对肠道的酸和胆盐等不良环境有一定的耐受性，同时能够黏附在肠上皮细胞上才能发挥其益生功能[6]。笔者从实验室保藏的乳酸菌中筛选出耐酸耐胆盐能力及黏附能力较强的乳酸菌，研究其对肠道病原菌的抑制能力，为其进一步应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与主要试剂。
试验菌株，江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室提供。胆盐，美国Difco公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，上海生工生物工程公司；DNA提取试剂盒，上海生工生物工程公司；艰难梭菌、大肠杆菌、沙门氏菌，中国微生物菌株保藏中心；IEC-6细胞，上海麦莎生物科技有限公司；DMEM培养基，美国Invitrogen公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司；强化梭菌培养基，青岛海博生物技术有限公司；抗生素药敏试纸，杭州天和微生物试剂有限公司。
1.1.2 主要仪器设备。JF-SX-500全自动灭菌锅，日本TOMY公司；Thermo Scientific 1300生物安全柜、Legendmach1.6R高速冷冻离心机，美国塞默飞世尔科技有限公司；OlympusCX41生物显微镜，日本Olympus公司；UV-2550紫外分光光度计，日本岛津公司；PCR扩增仪，美国ABI公司；Infinity3026凝胶成像系统，法国Vilber Lourmat公司。
1.1.3 主要试剂的配制。
模拟胃液：0.3%的胃蛋白酶溶于PBS溶液，1 mol/L HCl调pH至3.0，经0.22 μm滤膜过滤除菌，现配现用。
模拟肠液：0.1%的胰蛋白酶溶于PBS溶液，0.4% NaOH溶液调pH至8.0，经0.22 μm滤膜过滤除菌[7]，现配现用。
1.2 方法
1.2.1 乳酸菌的培养处理。
将活化后的乳酸菌按3%的接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h后，10 500 r/min离心10 min收集菌体，用灭菌的PBS溶液将菌体洗涤后悬浮，并调整其OD560nm为1.0，4 ℃冰箱冷藏备用。
1.2.2 IEC-6细胞的培养。
将IEC-6细胞置于DMEM培养液中，于37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养，隔天更换1次培养液，当细胞增殖融合率达80%时，用0.25%的胰酶（0.02%EDTA）消化细胞，传代5次后进行下一步试验。
1.2.3 致病菌的培养与处理。
将沙门氏菌、大肠杆菌以3%的接种量接种到LB液体培养基中，艰难梭菌以3%的接种量接种到RCM培养基中，活化3代，37 ℃培养24 h，利用平板计数法测定其活菌数，用灭菌的培养基调整其活菌数为107 CFU/mL，4 ℃冷藏备用。
1.2.4 乳酸菌的耐酸耐胆盐能力。分别取1.0 mL的乳酸菌菌悬液于9.0 mL的模拟胃液和9.0 mL的模拟肠液中，于37 ℃分别培养3 h和4 h后测定其活菌数，按公式（1）、（2）计算其存活率。将乳酸菌菌悬液按3%的接种量接种于含0.30%胆盐及不含胆盐的MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h测定其OD600nm值，按公式（3）计算其存活率。
存活率=3 h的活菌数/0 h的活菌数×100% （1）
存活率=4 h的活菌数/0 h的活菌数×100% （2）
存活率=含胆盐培养基的OD值/不含胆盐培养基的OD值×100% （3）
1.2.5 乳酸菌的黏附能力。
调整IEC-6细胞的浓度为2×104 cells/mL，接种于培养板中，预先置入22 mm×22 mm无菌盖玻片，使细胞贴附盖玻片生长，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。用PBS冲洗并调整培养后的乳酸菌，使其菌体浓度为1×108 CFU/mL。待细胞长成致密单层后，用PBS缓冲液漂洗细胞2次，然后每孔加入不含抗生素的1 mL DMEM培养液和1 mL上述制备好的乳酸菌菌悬液，轻轻摇晃混匀，置于CO2培养箱继续孵育，每株菌重复3孔。
培养60 min后，用PBS缓冲液洗涤细胞5次，除去未黏附的乳酸菌，然后加入无水甲醇固定20 min，对细胞进行革兰氏染色，显微镜下随机选取20个视野，计算100个细胞上黏附的乳酸菌个数，以平均每个细胞所黏附的乳酸菌个数表示黏附能力[8]。
1.2.6 乳酸菌的抑菌能力。
采用单层琼脂平板扩散法[9]，将固体LB培养基溶化后倒入平板中，待冷凝后，取菌液浓度为108 CFU/mL的0.20 mL致病菌菌液加入培养基平板上，用无菌涂抹棒在超净工作台内将致病菌菌液涂抹均匀，待菌液固定在培养基表面后打孔，将活化好的乳酸菌发酵菌液注入孔内至满孔，于37 ℃培养10 h，测量抑菌圈直径，该试验需重复3次。判定标准（含打孔器直径）：无抑菌圈为不抑菌，10～15 mm为低度抑菌，15～20 mm为中度抑菌，大于20 mm为高度抑菌。
1.2.7 乳酸菌的鉴定。
利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取乳酸菌的基因组DNA，参考文献[10]的方法进行16S rDNA-PCR扩增，电泳检测扩增产物后送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将测序结果通过BLAST程序与GenBank基因库进行在线比对以得出结果。
1.2.8 数据统计与处理。采用SPSS 20.0、Origin软件对试验数据进行统计和分析。
2 结果与分析
2.1 乳酸菌對胃肠液的耐受性
由表1可知，不同乳酸菌的耐酸能力不同，其中菌株C13、A17、A90、A04、A03、T70、R07、Z05、A70、R04、R23及A90在pH 3.0的人工模拟胃液中培养3 h存活率均大于44.00%，显著高于其他菌株（P<0.05），而在模拟人工肠液中培养4 h的存活率均大于51.56%，也显著高于其他菌株（P<0.05）。有17株乳酸菌在人工胃液和肠液中的存活率均高于20.00%，选取这17株乳酸菌进行下一步试验。
2.2 乳酸菌的耐胆盐能力
由表2可见，17株乳酸菌在胆盐浓度为0.3%培养基中培养24 h的存活率不同，其中菌株R04、A17、B02、C13的存活率均高于49.00%，显著高于其他菌株（P<0.05）；菌株A90、A04、A01、A03、A32及R07的存活率也较高，均大于20.00%，表明它们对胆盐具有良好的耐受性。因此，选取这10株菌进行下一步的黏附试验。
2.3 乳酸菌的黏附性
从图1可知，试验的10株乳酸菌对IEC-6细胞的黏附能力差异较大，菌株A32、A01、B02、R02及R02对IEC-6细胞黏附个数均低于5个/cell，而C13、A03、A17、A90对IEC-6细胞黏附个数均大于8个/cell，表明这4株菌具有良好的黏附定殖能力。
2.4 乳酸菌抑制肠道病原菌的能力
由表3可以看出，C13、A17、A03、A32及R07对艰难梭菌的抑制能力较强，显著高于其余5株乳酸菌（P<0.05），其中菌株A03对艰难梭菌的抑菌圈直径达23.22 mm，而菌株R04及A90对艰难梭菌没有抑制能力；菌株A90、A17、R07、A01、C13、A03及A04对沙门氏菌的抑制能力显著高于其余3株菌株（P<0.05），其中A90对沙门氏菌的抑菌圈直径达24.76 mm；菌株C13、A03、A17、A01及A32对大肠杆菌的抑制能力显著高于其余3株菌株（P<0.05），C13抑制大肠杆菌的能力最强，抑菌圈直径达23.46 mm。
综合上述试验结果发现，菌株C13及A03同时抑制艰难梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌的能力较强。
2.5 乳酸菌的16S rRNA鉴定
分别以菌株C13及A03的基因組DNA为模板，采用通用的16S rRNA引物进行PCR扩增，得到约1 500 bp的特异性扩增产物，扩增条带如图2所示。
由表4可知，测序得到的序列与GenBank数据库中标准菌株的同源性均为99%，因此，将菌株C13和A03分别鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。
3 结论
导致抗生素诱导肠道菌群紊乱的典型菌株有耐药性G+肠球菌和G-肠杆菌，其中以艰难梭菌、沙门氏菌、大肠杆菌最为常见[11]，这些微生物的最适生长pH为6.0～7.0，如果低于该值，生长速率会降低或不生长甚至死亡。该研究发现，对酸有较强耐受性的乳酸菌，其对致病菌的抑制能力也较强，而乳酸菌能通过产酸来抑制有害菌的生长[12]，表明试验乳酸菌对酸产生耐受性的过程也是适应其自身不断产酸的过程[13]。该研究还发现，试验乳酸菌对IEC-6细胞的黏附能力较强，而乳酸菌还可通过同致病菌竞争肠道上皮细胞的黏附位点来抑制其繁殖[5]；黏附能力较强的乳酸菌与肠黏膜细胞紧密结合，形成生理屏障，保护肠道的微生态平衡。由于乳酸菌不含过氧化氢酶，因此在环境中不断积蓄过氧化氢，也对致病菌起到了抑制作用。该研究从实验室保藏的27株乳酸菌中筛选出了耐酸耐胆盐能力及对IEC-6细胞黏附能力较强的鼠李糖乳杆菌C13及植物乳杆菌A03，其对艰难梭菌、沙门氏菌及大肠杆菌的抑制能力也较强，可作为抑制肠道致病菌的候选益生菌株进一步研究。
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