摘要：为获得并鉴定高效拮抗油茶主要真菌病害的拮抗菌，研究其拮抗作用，采用点接法和发酵培养法从油茶根部土壤分离获得1株能同时拮抗6种油茶病害真菌的拮抗菌。通过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，将该拮抗菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌，并命名为Bacillus amyloliquefaciens D2WM。该拮抗菌能拮抗油茶炭疽病病菌（Colletotrichum nicotianae）、胶孢炭疽病病菌（C. gloeosporioide）、叶斑病病菌（Phyllosticta capitalensis）、软腐病病菌（Agaricodochium camellia）、黑斑病病菌（Altermaria alternate）和溃疡病病菌（Bothyosphaeria dothidea）6种油茶病害病原菌，且拮抗菌发酵产生的无菌滤液对以上6种病原菌的抑菌率均高于95%。同时，D2WM菌株发酵产生的10倍稀释菌液还对细菌性软腐病病原菌欧文氏菌3个亚种的抑菌圈均大于22 mm，是1株具有广谱拮抗作用的生防菌株。D2WM菌株发酵液耐酸碱范围广，在pH值为9时拮抗作用最佳；不耐高温，温度达到80 ℃及以上时抑菌活性完全喪失。研究结果对细菌性软腐病及油茶无公害防治提供了理论基础和参考依据。
关键词：解淀粉芽孢杆菌；鉴定；油茶病害；拮抗作用
中图分类号： S435.659 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）18-0100-05
收稿日期：2016-04-24
基金项目：国家自然科学基金（编号：31200488）；湖北省教育厅中青年人才项目（编号：Q20152707）；湖北省教育厅重点项目（编号：D20102704）；特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金重点项目（编号：2016K07）。
作者简介：魏 蜜（1987—），女，湖北孝感人，博士，讲师，主要从事微生物学和植物病害防治等方面的研究。Tel：（0712）2345155；E-mail：weimi555@163.com。 油茶（Camellia oleifera）属山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia），是我国特有的一种高级油料作物，主要生长于中国南方亚热带地区高山及丘陵地带，是重要的木本油料树种之一[1]。油茶病害种类繁多，油茶炭疽病、油茶叶枯病、油茶软腐病是油茶生产中3种毁灭性病害，在我国各油茶产区普遍发生，油茶的地上各部位均可受害[2]，且油茶黑斑病、油茶溃疡病等也时常发生，每年油茶产业因上述真菌性病害造成了巨大的经济损失。
芽孢杆菌（Bacillus）是一类理想的生防菌，在目前生防细菌中研究较多。周盈等报道了1种对胡萝卜软腐欧文氏菌具有抑菌活性的枯草芽孢杆菌BSn5及其产生的抑菌蛋白APn5，但该菌只能拮抗胡萝卜软腐欧文氏菌亚种，其生防范围较窄[3]。刘君昂等公开了1种拮抗油茶病害的短芽孢杆菌Z26，它能有效抑制油茶炭疽病病菌、根腐病病菌、半边疯病菌等病原菌的生长，该生防菌剂对油茶炭疽病的最大抑制率达到 83.4%[4]。陈琼珍等利用枯草芽孢杆菌对有害真菌的生防作用及最佳发酵条件进行研究，结果显示枯草芽孢杆菌只对红镰刀菌的拮抗作用明显[5]。目前，关于解淀粉芽孢杆菌能同时在油茶主要真菌性病害及细菌性软腐病上的防治研究及应用报道较少。
本研究从油茶根部土壤分离获得1株能拮抗油茶主要病害真菌的解淀粉芽孢杆菌D2WM。采用平板对峙法和发酵培养法研究该拮抗菌对油茶6种病害真菌的拮抗作用。另外，使用管碟法测定该拮抗菌的无菌发酵液对细菌性软腐病病菌的拮抗作用。最后本研究对拮抗菌发酵菌液的理化性质进行了初步研究，为油茶真菌病害及蔬菜细菌性软腐病的无公害防治提供了一定的理论基础和参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
菌株来源：油茶炭疽病病菌（Colletotrichum nicotianae）、油茶胶孢炭疽病病菌（C. gloeosporioides）、油茶叶斑病病菌（Phyllosticta capitalensis）、油茶软腐病病菌（Agaricodochium camellia）、油茶黑斑病病菌（Altermaria alternate）、油茶溃疡病病菌（Bothyosphaeria dothidea），均分离自湖北孝感大悟油茶林地；胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种（Erwinia carotovora ssp. carotovora）、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种（E. carotovora ssp. atroseptica）、菊欧文氏菌（E. chrysanthemi），均分离自湖北孝感当地蔬菜田中腐烂的蔬菜。所有菌株均保存于湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室。
1.2 培养基[6]及主要试剂和仪器
LB培养基（筛选培养基）：1 L中含有10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl、15～20 g琼脂，pH值7.0～7.2，用去离子水调至总体积为1 L；牛肉膏蛋白胨培养基（分离培养基）：1 L中含有3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，15.0 g琼脂，pH值7.2～7.4，用去离子水调至总体积为1 L。上述培养基分装后于121 ℃灭菌20 min，备用。
DNA凝胶回收试剂盒、PCR反应用的各种试剂，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白胨、酵母粉、NaCl、琼脂等，均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.3 拮抗菌的筛选、分离及拮抗作用研究
采用稀释分离法[7]从油茶根部土壤分离拮抗细菌，取 10 g 健康油茶根际土样加入到盛有90 mL无菌水和玻璃珠（直径0.5 cm，每瓶30～50个）的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min 摇床中振荡20 min后，将菌悬液放置在80 ℃水浴中保持15 min。将1 mL土壤悬浮液移入盛有9 mL无菌水的试管中，制成10-1菌悬液，依此类推，获得10-2、10-3、10-4、10-5、10-6菌悬液。梯度稀释后，吸取100 μL稀释度为 10-6～10-3的菌悬液均匀涂布在分离培养基上，将涂布有菌悬液的平板置于30 ℃培养箱内培养，24 h后观察分离培养基上菌落的状态，用三步划线法进行分离纯化，统一编号登记。接种斜面后，可在4 ℃短暂保藏，用50%甘油作为保护剂，可在-80 ℃长久保藏。
采用平板对峙法[8]筛选能同时拮抗各油茶病原真菌的拮抗细菌，将直径为7 mm的病原菌饼置于PDA平板中心，然后用无菌牙签蘸取待测菌，于等距离点（距平板中央1.5 cm）接拮抗菌，置于28 ℃恒温培养箱培养，5 d后观察抑菌带的大小，每个处理重复3次，筛选抑菌带宽大于5 mm的菌株。
将初筛有拮抗作用的菌株在LB液体培养基中于 150 r/min 适温培养24 h，发酵菌液以8 000 r/min离心 10 min，上清用0.22 μm微孔滤膜过滤至灭菌EP管中。将初筛拮抗菌滤液与约50 ℃的PDA固体培养基按体积比1 ∶ 19混匀后倒入培养皿，冷却后在平板中央放入直径为7 mm的油茶病原真菌菌饼，以无菌水为对照，每个处理3次重复，5 d后测量病原菌菌落直径。无菌滤液抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-0.7）×100%。
采用平板对峙法分析拮抗菌对真菌主要病害的拮抗作用[8]：将打好的直径为7 mm的油茶炭疽病等病原菌菌饼置于PDA平板中心，然后用无菌牙签蘸取待测菌，于等距离点（距平板中央1.5 cm）接拮抗菌，置于28 ℃恒温培养箱中培养，5 d后观察抑菌带的大小，每个处理重复3次。采用管碟法[9]分析拮抗菌对欧文氏菌的拮抗作用：在涂布有100 μL病原菌（约1×107 CFU/mL）的LB琼脂平板上等距离用打孔器打直径为7 mm的孔。每个孔中接入50 μL发酵液10倍稀释液，以无菌水为对照，每个处理设置3次重复。在30 ℃恒温箱中培养20～28 h后测量抑菌圈直径，根据数值大小确定拮抗程度。
1.4 拮抗菌株鉴定
1.4.1 拮抗菌的形态特征和生理生化鉴定 将纯化后的菌种转接到LB平板上，于30 ℃培养24 h后，对菌落形态、颜色、基质颜色及有无运动性等进行形态特征鉴定，并依据东秀珠等的方法[10]对拮抗菌株进行生理生化鉴定。
1.4.2 拮抗菌株的16S rDNA PCR扩增和序列测定 拮抗菌株基因组DNA的提取方法参考文献[11]。采用生工生物工程（上海）股份有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（编号：B518225）提取细菌基因组DNA，-20 ℃保存。
采用细菌的通用引物F27（AGAGTTTGATCCTGGCT CAG）和R1492（TACGGCTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增，得到该细菌的16S rDNA。PCR反应总体系为50 μL：各 2 μL 引物F27和R1492（由天一辉远生物科技有限公司合成）、5 μL 10×buffer、2 μL dNTP、1 μL Taq酶、5 μL MgCl2、33 μL 双蒸水。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共设35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，通过凝胶成像系统显示并记录电泳结果。PCR产物委托天一辉远生物科技有限公司进行纯化和测序。
1.5 拮抗菌株无菌发酵液的特性研究
酸碱稳定性测定[12]：将拮抗菌株菌液经无菌滤器过滤，吸取5 mL无菌滤液转入无菌试管中，用1 mol/L NaOH或HCl调pH值分别至1、3、5、7、9、11、13，静置1 h后，测试不同pH值拮抗菌株菌液对欧文氏菌的抑制作用。以不调pH值的滤液作为对照，每个处理重复3次。
热稳定性研究[13]：将拮抗菌液经无菌滤器过滤，取5 mL无菌滤液转入无菌试管中，分别在20、40、60、80、100 ℃下处理2 h，测试不同温度处理的拮抗菌株菌液对欧文氏菌的抑制作用。
2 结果与分析
2.1 拮抗菌的筛选和分离
以实验室分离到的油茶炭疽病病菌（C. nicotianae）为指示菌，以分离得到的菌株为待检菌，将分离纯化得到的细菌利用平板对峙法依次筛选，初步确定对油茶主要真菌病害有拮抗作用的3株菌株D2WM、D9WM、D21WM。然后采用发酵法进行复筛，最终确定D2WM的拮抗作用最强。
2.2 拮抗菌株D2WM的形态学及生理生化特性分析
如图1所示，D2WM菌株的菌体呈杆状，周生鞭毛，并具有运动性；菌落为乳白色，呈近圆形，表面粗糙有褶皱，边缘不规则，不产生可溶性色素。生理生化鉴定结果表明，该菌株属于革兰氏阳性菌，具有接触酶活性，能水解淀粉，能利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖产酸，能利用柠檬酸盐，能够水解酪素并使明胶液化，能够还原石蕊牛奶和硝酸盐，伏-普（V-P）反应呈阳性，不具有卵磷脂酶活性，不能水解马尿酸鹽和酪氨酸，不能利用葡萄糖产气。
2.3 拮抗菌株D2WM的分子鉴定及系统发育树构建
对菌株D2WM进行分子鉴定，将测得的16S rDNA序列（片段长度为1 439 bp）与GenBank数据库中的序列进行BLAST分析，选取9株菌株用ClustalX 2.1进行多序列比对分析，利用MEGA 6.0软件采用邻接法（Neighbor-Joining）进行系统发育树构建和聚类分析，如图2所示。菌株D2WM（登录号为KU973511）与GenBank中登录号为HM107808.1[解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） strain 15]菌株的同源性达到99%。依据16S rDNA分类标准，一般认为16S rDNA序列同源性大于97%，可认为属于同一个种。结合上述形态和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌株D2WM属于解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）。
2.4 拮抗菌株D2WM的拮抗作用分析
采用平板对峙法和发酵菌液培养法开展解淀粉芽孢杆菌D2WM与多种油茶病原菌拮抗作用研究。由图3可知，解淀粉芽孢杆菌D2WM对油茶炭疽病、油茶胶孢炭疽病、油茶叶斑病、油茶软腐病、油茶黑斑病和油茶溃疡病6种油茶病害致病菌均有较好的拮抗作用，尤其是对油茶炭疽病病菌、叶斑病病菌、黑斑病病菌的拮抗效果明显。由表1可知，解淀粉芽孢杆菌D2WM对油茶主要病害致病菌的抑菌率均高于95%，尤其是对叶斑病病菌的抑菌率达到100.00%。上述结果表明，解淀粉芽孢杆菌D2WM的抗菌谱较广，是1株针对油茶主要病害的高效生防菌株。
另外，本研究还考察了解淀粉芽孢杆菌D2WM发酵液对细菌性软腐病菌欧文氏菌的拮抗作用。由图4可知，D2WM发酵液的10倍稀释液对胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种、菊欧文氏菌3个亚种的抑菌圈直径均大，抑制效果较好，其无菌水对照处理组均未出现抑菌圈。
2.5 拮抗菌株D2WM的拮抗物质特性研究
2.5.1 酸碱稳定性研究 由图5可知，D2WM菌株发酵液的无菌滤液酸碱耐受范围较广，在pH值为1～11范围内对软腐病病原菌均有一定的抑制效果，并且在pH值为9时，其抑制效果最佳，证明偏碱性的环境更有利于无菌滤液中的有效成分发挥拮抗作用。
2.5.2 热稳定性研究 由图6可知，D2WM菌株发酵液的无菌滤液在20～60 ℃范围内保留抑菌活性。试验同时得到未经处理的无菌滤液在室温25 ℃条件下的抑菌圈直径为（31.2±0.4）mm。结果表明，温度大于40 ℃时会减弱无菌滤液的拮抗效果，当温度高于80 ℃时，抑菌活性丧失，说明该无菌滤液中的有效成分不耐高温。
3 讨论与结论
本试验通过对油茶主要病害的拮抗菌进行双重筛选，最终获得1株能同时高效拮抗油茶主要病害和欧文氏菌的解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）D2WM。该菌株分离自油茶健康植株根际土壤，经检测无致病性，具有较稳定的生防作用。现有报道中解淀粉芽孢杆菌多见于对真菌的抑制，王英国等从堆肥中分离到1株解淀粉酶芽孢杆菌，通过产生抗菌多肽类物质拮抗尖孢镰刀菌、草莓蛇病菌、毛霉和黑曲霉等多种真菌[14]。勾长龙等分离获得1株对人参根腐病病原菌拮抗作用较强的解淀粉芽孢杆菌HB-3，其无菌发酵液对人参根腐病病菌菌丝生长和孢子萌发均有显著的抑制作用[15]。同时也有利用解淀粉芽孢杆菌对采后柑橘绿霉病的生防效果的相关研究等[16]。本研究筛选得到的解淀粉芽孢杆菌對油茶的6种主要病害真菌均有较好的抑制作用，同时还能较好地抑制细菌性软腐病欧文氏菌的3个亚种，说明解淀粉芽孢杆菌确实是理想的生防菌株来源。
研究表明，解淀粉芽孢杆菌可产生抑菌蛋白类、脂肽类抗生素、大环内酯类、寡肽酶、肽类和聚酮化合物等[17-21]。本研究对解淀粉芽孢杆菌D2WM的抑菌物质特性研究表明，其无菌滤液耐酸碱范围较广，在偏碱性条件下的抑菌活性更高，但是其热稳定性较差，推测其抑菌物质成分中含有蛋白类[18]。下一步将分别采用有机溶剂提取法和硫酸铵沉淀法从菌株发酵液中制备出抑菌物质粗提液和粗蛋白液，并对活性粗提物进行高效液相色谱（HPLC）法、高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）分析[22-23]，为揭示拮抗菌的物质基础和拮抗机制奠定基础。另外，该拮抗菌株液体培养代谢产物只需要在LB液体培养基中培养12～20 h即可获得较好的拮抗效果，相对于一般细菌、真菌大大缩短了培养时间，降低了生产成本[6]。
目前，对油茶主要病害和细菌性软腐病普遍通过种植抗性品种和化学防治来控制，过多地使用化学杀菌剂有危害人类身体健康、药物残留破坏生态环境、引发病原物产生抗药性、影响产品质量和食用安全等诸多缺点，不利于绿色可持续发展[4]。寻求安全、高效和经济的生物源农药已成为当前防治细菌性软腐病和油茶病害的热点和当务之急，其中拮抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。本研究首次报道了单一微生物菌剂同时防治多种油茶病原真菌和欧文氏菌的3个亚种，在油茶真菌病害及蔬菜细菌性软腐病的无公害防治上有一定的应用潜力。
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