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[摘要] 目的 研究滇重楼内生真菌多样性。 方法 本实验对云南弥勒和临沧野生滇重楼内生真菌进行分离，并基于16S rDNA序列分析和形态学方法进行鉴定。 结果 从两地滇重楼中共分离得到42株内生真菌，分别归属于16个属。其中弥勒滇重楼归属于13个属，而临沧滇重楼归属于8个属。 结论 滇重楼内生真菌的差异性可能与宿主生存环境及分离部位的结构和成分等因素有关。
[关键词] 滇重楼；内生真菌；分离；鉴定；多样性
[中图分类号] R939.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）03（c）-0012-04
Diversity research of endophytic fungi from Paris polyphylla var. yunnanensis
DUAN Rongting LI Hongtao LI Hongyu ZHOU Hao▲ YANG Xueqiong CAI Le YANG Yabin
School of Chemical Science and Technology， Yun"nan University， Yun"nan Province， Kunming 650091， China
[Abstract] Objective To investigate the diversity of endophytic fungi from Paris polyphylla var. yunnanensis. Methods The endophytic fungi were isolated from wild Paris polyphylla collected from Mile and Lincang of Yun"nan Province， and identified by 16S rDNA sequence analysis and morphological method. Results 42 strains of endophytic fungi were classified into 16 genus. Meanwhile， 13 genus and 8 genus endophytic fungi were isolated from Paris polyphylla of Mile and Lincang respectively. Conclusion It is reasonable to propose that the differences of endophytic fungi are related to different habitat， constituents and isolating positions of the host.
[Key words] Paris polyphylla var. yunnanensis； Endophytic fungi； Isolation； Identification； Diversity
滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis（Franch.）Hand.）为延龄草科（Trilliaceae）重楼属一种多年生草本植物，主要分布在我国云南、四川、贵州等地[1]。滇重楼是名贵的药用植物，主要以其干燥的地下根茎入药，是中药重楼的主要药用种，也是云南某著名中成药的原料药。滇重楼根茎中含有的甾体化合物，具有止血、抗肿瘤、抗微生物和免疫调节等活性[2]。它的消耗主要依靠野生重楼，而滇重楼的自然繁殖率很低，生长周期较长。随着滇重楼的价格上涨，人类的采挖速度远超过其自然生长速度，使滇重楼资源面临稀缺状态。近年来，生物学各领域的研究学者对滇重楼这一云南特有的珍贵药用植物资源开展了相应学科的研究[3-4]。
植物内生真菌（endophytic fungus）是指在健康宿主植物中生存并完成一定阶段或全部阶段生命周期，但不会引起宿主病理症状的微生物[5-6]。已有研究表明，滇重楼根状茎能多年健康的在地下生存，其根状茎中不但含有种类丰富的内生真菌[7-8]，而且这些内生真菌还能够产生一些抗菌活性物质来抑制抵抗病原物的侵袭[9-11]。此外还发现，滇重楼内生真菌能产生与宿主活性成分相同或相似的甾体皂苷类化合物[12]。目前有关重楼内生菌的次生代谢产物研究还较少，对其进一步的研究将为寻找重楼有效成分提供新的来源，也将为寻找和发现新的药物活性成分提供重要依据。
王茜等[8]对来自于云南嵩明、鹤庆及保山的野生滇重楼内生真菌菌群多样性进行了深入的研究。本实验按照根、茎、叶三个部位分别对采集自云南弥勒和临沧的野生滇重楼内生真菌进行分离，再利用形态学鉴定和16S rDNA序列分析对分离到的内生真菌进行鉴定。探讨两地滇重楼各部位间内生真菌菌株的差异性和多样性。同时本实验通过对不同产地滇重楼内生真菌多样性的分析，为进一步筛选发现活性菌株及其活性成分研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 滇重楼植株样品
实验研究的重楼植株于2015年5月分别采自云南弥勒和临沧，均为无病虫害的健康植株，由昆明医科大学杨淑达副教授鉴定为滇重楼。采集后低温保存，分别取两地滇重楼的根、茎、叶部位进行内生真菌的分离。
1.2 内生真菌的分离
低温保存的滇重楼植株各部位用无菌水洗净；放入2.5%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒2 min，取出用无菌水冲洗3次；75%的乙醇浸泡2 min，无菌水清洗3次；各部位用無菌滤纸吸干水分，分别放入无菌培养皿中晾干。用无菌解剖刀将根部位切成1 cm长的小段，茎部位切成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm大小的方块，叶片切成0.2 cm×0.2 cm大小的片状。处理好的各部位分别接入PDA培养基（含青霉素质量浓度为120 μg/L）中，每个培养皿内接种6块组织，两种滇重楼不同部位分别接15皿，放置于28℃培养箱中培养7 d。观察各培养皿内菌株菌落形态并归类、接种纯化，已纯化的菌种保藏在PDA斜面培养基内。
1.3 菌株鉴定
以《真菌鉴定手册》[13]和《半知菌属图解》[14]为参考，对纯化后的菌株进行基本的分类，包括从菌株的群体形态和个体形态进行比较，具有相似形态的菌株归为同类。
采用CTBA法提取真菌基因组DNA。ITS扩增使用的引物为ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），两者为通用引物，由上海生工生物工程公司合成。50 μL PCR反应体系为：5 μL 5×PCR Buffer，4 μL dNTPs（10 mmol/L），1 μL ITS1，1 μL ITS4，0.3 μL Tap酶，1 μL DNA模板，其余用ddH2O补足，终体积为50 μL。PCR扩增条件为：预变性94℃ 4 min，变性94℃ 1 min，退火56℃ 1 min，延伸72℃ 1 min 30 s，循环32次，最后延伸72℃ 10 min。扩增后送昆明硕擎生物公司测序，测序结果在NCBI的GenBank数据库中通过Blast搜索对比。以相似度最高的序列为参考，并用于系统发育分析。
1.4 多样性分析
运用BioXM2.2，ClustalX1.83对序列进行分析，并用MEGA 5.0构建系统发育树。以Kimura-2模型计算进化距离，通过邻接法1000步重估得到的自展检验数值，使用TreeView输出树形图。
本实验参考王茜等[8]的方法计算分离率、Shanno-Wienner多样性指数和相似性系数（J）来分别分析两地滇重楼各部位的内生真菌分布情况、丰富程度、不同来源的均匀度及相似性程度。
2 结果
2.1 内生真菌的种群
对两地滇重楼按照根、茎、叶三个部位进行内生真菌分离，从中共得到42株内生真菌，经形态学鉴定和16S rDNA分析将其鉴定为16个属，见表1。链格孢属（Alternaria）和曲霉属（Aspergillus）为分离到的所有内生真菌中的优势菌种群，分别占菌株总数的19.05%和14.29%。根部共分离到6株内生真菌，分别归属于镰刀菌属（Fusarium）和青霉菌属（Penicillium）。叶部共分离得到内生真菌13株，分别归属于5个属，其中炭疽菌属（Colletotrichum）和球腔菌属（Mycosphaerella）仅在叶部分离得到。茎部分离得到内生真菌23株，分别归属于14个属，其中枝孢属（Cladosporium）、间座壳属（Diaporthe）、亚隔孢壳属（Didymella）、壳针孢属（Septoria）、小鬼伞属（Agaricus）、烟管菌属（Bjerkandera）、栓菌属（Trametes）、弯孢壳属（Eutypa）和茎点霉属（Phoma）仅在茎部出现，茎部内生真菌表现出最好的多样性。
两地滇重楼茎部内生真菌ITS序列与参考序列构建的N-J树见图1。从N-J树可以看出两地滇重楼茎部除了共有的内生真菌种属还各自存在特有种属，说明不同产地滇重楼内生真菌的种类存在一定的差异。
A：弥勒；B：临沧
图1 两地滇重楼茎部内生真菌ITS序列与参考序列构建N-J树
2.2 内生真菌的分布特征
通过分析分离率可以衡量特定样品中内生真菌的丰富程度及其多重浸染的频率。弥勒滇重楼和临沧滇重楼在不同采集地、組织部位之间表现出明显的差异性，其中两地滇重楼根部的分离率相同，均为0.03。茎部的分离率弥勒的较高，为0.2。叶部分离率以临沧的较高，为0.012。同一采集地的滇重楼不同部位的分离率也存在差异，弥勒滇重楼的茎部分离率最高，叶部分离率最低；临沧的根部和茎部分离率相同且高于叶部。对比分离到的内生真菌种类，以链格孢属真菌的分离率最高，为0.13。
2.3 内生真菌的多样性
通过分析内生真菌Shanno-Wienner多样性指数可以反映其丰富程度和不同来源的均匀度。根据分析结果可知，不同产地滇重楼的不同部位内生真菌存在明显差异，其中，弥勒滇重楼茎部分离得到的内生真菌多样性指数最高，为2.16；从滇重楼不同部位分离到的内生真菌多样性指数相比，茎部内生真菌多样性指数较高，为2.46；而两地滇重楼内生真菌的多样性指数相比，弥勒滇重楼内生真菌多样性指数（2.26）高于临沧（1.80）。见表2。
表2 两地滇重楼内生真菌群落多样性指数
注：“-”表示无内容
2.4 内生真菌的相似性
两地滇重楼不同部位分离到的内生真菌的相似性可用相似性系数（J）表征，其中，根茎间J值为0.17，根叶间J值为0.00，茎叶间J值为0.23，各部位间的J值均在0.25以下，极不相似。两产地相比J值为0.45，为中等不相似。结果表明不同产地、不同部位间的内生真菌组成并不相似。
3 讨论
本实验从弥勒及临沧滇重楼植株内共分离得到42株内生真菌，分别属于子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycotina），进一步归属为16个属。不同产地滇重楼各部位分离到的内生真菌种属存在一定差异，其中9个属仅在茎部分离得到，2个属仅在叶部分离得到。弥勒滇重楼内生真菌归属为13个属，临沧滇重楼归属为8个属，弥勒滇重楼内生真菌种属比临沧滇重楼更具多样性。结果表明，滇重楼内生真菌在不同生长环境及分离部位存在较明显的差异性和多样性，而且植物的生存环境和外界条件有可能影响其内生真菌的组成[15]。此外通过对相似性的分析，表明两地滇重楼不同部位内生真菌组成不相似。
目前，对于滇重楼内生真菌的研究主要集中在块茎部，有关根部和叶部的内生真菌的报道还较少[8]。本研究在叶部分离到特有的球腔菌属和炭疽菌属内生真菌，进一步丰富了滇重楼内生真菌多样性，为滇重楼内生真菌的分布和筛选提供了科学依据。研究表明，重楼内生真菌能够代谢活性物质，部分内生真菌还可以转化产生宿主活性成分[12，16]。因此，研究滇重楼内生真菌的多样性对促进滇重楼内生真菌活性物质开发、新资源利用等方面具有重要的研究价值和应用前景[17]。
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（收稿日期：2016-11-15 本文编辑：程 铭）
