摘要：从生姜连作地土壤中分离到1株对生姜青枯假单胞杆菌（Pseudomonas solanacarum Smith）有强拮抗作用的沙雷氏菌株R11，对该菌株进行了形态特征、培养特征、生理生化和16S rDNA序列分析的系统鉴定，发现R11为革兰氏阴性菌，端生一根鞭毛。以16S rDNA序列为基础构建了包括11株相关种属细菌在内的系统发育树，R11与沙雷氏菌（Serratia sp.）十分接近，序列相似性值达99%。
关键词：沙雷氏菌（Serratia sp.）;16S rDNA;青枯假单胞杆菌（Pseudomonas solanacarum Smith）
中图分类号：Q939 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）20-4841-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.018
Isolation and Identification of a Serratia sp. Strain Against Ginger Bacterial wilt Caused by Pseudomonas solanacarum Smith
LI Xia1，ZHANG Xiao-ping1， LI Xin2
（1.Institute of Mountain Hazards and Environment，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China;2.Institute of Mordern Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730000，China）
Abstract：R11， isolated from soil of ginger in Sichuan Province， was effective in against ginger bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacarum Smith. The morphological， cultural， physiological and biochemical characteristics， and 16S rDNA sequences were studied. R11 was a gram-negative bacillus with a flagellum on the top. A phylogenetic tree was constructed by comparing with the published 16S rDNA sequences of the related bacteria species. In the phylogenetic tree， the overall similarity value between strain R11 and Serratia sp. was 99%.
Key words： Serratia sp.; 16S rDNA; Pseudomonas solanacarum Smith
中国生姜资源丰富，广泛种植于山东、陕西及南方各省市，日本、印度等东南亚国家以及南非、北美和澳大利亚也有栽培。生姜营养成分丰富[1]，现代医学证明其具有强心、杀菌、抗炎、抗运动病等作用[2]，对消化系统和心血管疾病等都有一定的防治作用[3，4]，还可以抑制体外肿瘤细胞的生长[5]。青枯假单胞杆菌（Pseudomonas solanacarum Smith）作为引起生姜姜瘟病的主要病原菌[6]，易侵入，侵染速度快，严重的可在半月左右造成生姜全田无收[7-9]，已成为制约生姜优质高产的毁灭性病害之一。
采用筛选抗病品种、施用化学农药等措施可防治姜瘟病发生，但是轮作和筛选抗病品种周期长，使用化学农药不仅不能从根本上防治病原菌，反而带来了环境污染[10]。生物防治可作为有效解决土传病害的一条有希望的途径[11]，利用拮抗菌防治姜瘟病无疑具有广阔的应用前景。目前，关于植物细菌性青枯病的生物防治，国内外研究工作很多，但针对姜瘟病的研究则较少[12，13]。冉红艳等[14]发现了1株青枯假单胞杆菌的拮抗菌，链霉菌菌株BC233;孙彩云等[15] 报道了10%的木霉菌株SMF2提取物能够产生直径达12 mm的抑菌圈;杨合同等[16]也筛选出能有效地降低青枯病菌的群体数的芽孢杆菌B1301。另外，欧艳华[17]报道了1株拮抗菌，为黏质沙雷氏菌株。本研究从生姜连作田土中分离筛选得到1株对青枯假单胞杆菌有强拮抗作用的沙雷氏菌株R11，并从细菌形态特征、生理生化特征以及基于16S rDNA序列的系统发育分析对该菌进行了系统鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种来源 菌株R11系生姜连作地土壤中分离得到。致病菌青枯病病原菌、大肠杆菌DH5α、pGEM-T载体由中国科学院成都生物研究所保存。
1.1.2 培养基 牛肉膏-蛋白胨培养基，甘油精氨酸培养基，高氏1号培养基和LB培养基。鉴定用试剂和培养基从海鸿实验仪器有限公司购买。
1.1.3 试验试剂 分离拮抗菌所用的试剂均为国产分析纯。Taq酶等均购自英骏生物公司。PCR引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。小量DNA胶回收试剂盒，产自天泽基因公司。
1.2 菌株的分离筛选
从生姜连作地土壤若干，将土样5 g经无菌生理盐水充分振荡10 min，制成1∶10（m∶V）土壤悬浮液，静置沉淀后，取上清梯度稀释后，涂布平板，28 ℃培养24～120 h。分离得到单菌落接种在涂布有姜瘟病原菌平板上，根据抑菌圈大小挑选初筛菌株。再将初筛菌株用改良自冉红艳等[14]的琼脂打孔法进行复筛，根据抑菌圈大小筛选出生姜青枯假单胞杆菌的强拮抗菌株。
1.3 形态特征和培养特征
于牛肉膏-蛋白胨培养基斜面上28 ℃培养24 h后，观察菌落形态。在四川大学华西医学中心透射电镜下观察个体形态并测量菌体大小，观察有无芽孢、鞭毛及其特征。
1.4 生理生化特征
参照文献[18，19]对R11进行生理生化鉴定。
1.5 16S rDNA的序列分析
参照文献[20]提取基因组总DNA，，用primer premier 5.0软件设计了1对PCR引物Primer A（5′-ATGGATCCGAGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′）和Primer B（5′-TATCTGCAGTGGTGTGACGGGCGGTGT-3′）。PCR扩增50 uL反应体系包括PCR反应体系：10×PCR缓冲液5 μL，MgCl2（25 mmol/L）3 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，引物A/B（20 μmol/L）各1 μL，模板DNA（约50 g/L）3 μL，Taq酶0.5 μL，双蒸水35.5 μL。PCR扩增条件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环;72 ℃ 10 min。
PCR扩增产物与pGEM-T载体连接后，将酶切及PCR鉴定初步正确的重组子送交上海英骏生物技术有限公司进行测序。在序列分析过程中，将测得的序列提交NCBI数据库应用BLAST程序与数据库中已有16S rDNA序列进行同源性比较分析，序列比较及系统发育分析采用用MEGA 5的Neighboer-Joining方法[21]。
2 结果
2.1 拮抗菌的分离筛选
初步分离出11株对病原真菌有拮抗作用的放线菌，9株拮抗细菌（表1）。将这20株菌用打孔法进行复筛，得到产生抑菌圈最大的菌株，即R11（图1），其抑菌圈直径接近1.2 cm。
2.2 拮抗菌R11形态和生化特征
R11在肉汤培养基上28 ℃培养，该菌株落开始时出现透明黏稠的菌落，呈圆形，光滑，湿润，表面隆起，边缘整齐，有轻微异味，培养24 h后菌落呈绿色，色素扩散到培养基中。电镜下R11是短小杆菌，有鞭毛。菌体长1.190～1.770 μm，宽0.658～0.920 μm，端生一根鞭毛（图2）。
生化性质具体鉴定结果见表2。所分离到的菌株与沙雷氏菌的生理特性较一致，该菌株为革兰氏阴性短杆菌，能利用赖氨酸、鸟氨酸、葡萄糖、蔗糖、山梨醇;不能利用精氨酸、乳糖、阿拉伯糖、棉子糖。不产生苯丙氨酸，可产生DNase和脲酶。
2.3 16S rDNA的序列分析
2.3.1 16S rDNA扩增产物 以R11基因组DNA为模板，引物Primer A 和Primer B为模板扩增出了一条长度约1 400 bp的PCR产物。扩增产物测序结果显示其长度为719 bp，其在Genebank中的登陆号为EU660208。
2.3.2 基于16S rDNA序列的聚类结果 根据R11的16S rDNA序列与GenBank中的序列比对发现，与其同源性最高的个模式菌株为沙雷氏菌。选取10个模式菌株，用MEGA 5软件构件系统发育树（图3）。可以看出R11与2个沙雷氏菌聚成一支，R11菌株的16S rDNA序列与沙雷氏菌同源性高达99%。
3 讨论
姜瘟病对生姜连作地的影响更为严重，其原因主要跟青枯假单胞杆菌（Pseudomonas solanacarum Smith）的持续繁殖有关。好的拮抗菌要能适应生姜种植环境、生存力强、拮抗性显著、特异性针对病原菌的特点，因此在发病率大于90%的生姜连做土壤区分离到对青枯假单胞杆菌具有较强拮抗作用菌株20株（表1）。拮抗菌和其他共生菌株不仅争夺青枯假单胞杆菌生长的营养、氧气及空间位置，并对生长增殖起抑制作用。R11菌株对病原菌抑菌圈直径约1.2 cm，是一种对青枯假单胞杆菌具有强拮抗作用的菌。拮抗微生物通过分泌1种或多种拮抗物质而直接抑制或杀死病原菌[22]。这些拮抗物质包括酶类、抗生素、细菌素或细菌素类似物，以及缺陷型噬菌体和具有抗菌作用的如氨类、有机酸、过氧化氢酶等初始代谢途径中的副产品和其他次生代谢物等[23]。
R11的基本形态和革兰氏表型与沙雷氏菌一致。通过电镜结果可知，R11是单生鞭毛菌（图2），而沙雷氏菌属为周生鞭毛菌，其鞭毛单生性质与沙雷氏菌周身鞭毛特性不一致，但宋建华等[24]的研究结果表明，沙雷氏菌也有单生鞭毛的情况出现。采用GenBank中与之同源性最高的11株细菌模式株的16S rDNA序列进行同源性比对分析，构建系统发育关系树（图3），其同源性与沙雷氏菌很相近，同源性高达99%。可以将拮抗菌R11最终鉴定为沙雷氏菌（Serratia sp.）。国内鲜有利用沙雷氏菌来拮抗生姜青枯假单胞杆菌的报道。本研究从生姜田土分离筛选到1株对生姜青枯假单胞杆菌有很强的抑制作用的沙雷氏菌R11，为姜瘟病的生物防治拓展了空间。有关菌株的其他特性及拮抗机理有待进一步研究。
参考文献：
[1] SHARMA I， GUSAIN D， DIXIT V P. Hypolipidemic and antiatherosclerotic effects of Zingiber officinale in cholesterol fed rabbits[J]. Phytotherapy Research， 1996， 10（6）： 517-518.
[2] 曹祚焕.生姜抗运动病的研究进展[J].中国药学杂志， 1993， 28（9）：531.
[3] PLATEL K，SRINIVASAN K. Influence of dietary spices or their active principles on digestive enzymes of small intestinal mucosa in rats[J]. Int J Food Sci Nutr.， 1996， 47（1）： 55-59.
[4] FURHRMAN B， ROSENBLAT M， HAYEK T， et al. Ginger extract consumption reduces plasma cholesterol， inhibits LDL oxidation and attenuates development of atherosclerosis in atherosclerotic， apolipoprotein E-deficient mice[J]. The Journal of Nutrition， 2000， 130（5）： 1124-1131.
[5] 任欣正，方中达.姜瘟病原细菌的鉴定[J].植物病理学报，1981，3（1）：51-56.
[6] KAKAR S S， ROY D. Curcumin inhibits TPA induced expression of c-fos， c-jun and c-myc proto-oncogenes messenger RNAs in mouse skin[J]. Cancer Lett.， 1994， 87（l）： 85-89.
[7] 何宗能.姜瘟病的发生与防治[J].现代农业科技， 2013（2）： 156， 160.
[8] 刘 铭，张 敏，戢俊臣，等.中国姜瘟病的研究进展[J].中国农学通报，2005，21（6）：337-340.
[9] 严金平，泽桑梓，张火云，等.姜细菌性青枯病病原菌及其防治研究进展[J].河南农业科学，2004（9）：63-65.
[10] 徐莹莹，杜秉海，丁延芹，等.生姜根际姜瘟病拮抗菌的筛选及鉴定[J].山东农业科学，2012，44（1）：79-83.
[11] 郭坚华，孙平华，吴云波，等.植物细菌性青枯菌的生物防治机制和途径[J].中国生物防治，1997，13（1）：42-46.
[12] 杨合同，庞定远，任欣正，等.姜瘟病生物防治试验初报[J].山东科学， 1990， 3（4）： 42-46.
[13] 霍沁建，张 深，王若焱.烟草青枯病研究进展[J].中国农学通报，2007，23（8）：364-368.
[14] 冉红艳，葛绍荣，陶 勇，等.一株拮抗姜瘟青枯假单胞杆菌的链霉菌的分离及鉴定[J].微生物学报，2005，45（3）：325-328.
[15] 孙彩云，潘 军，陈秀兰，等.抑制姜瘟青枯假单胞菌的木霉菌株的筛选及其抑菌机理[J].山东大学学报，2002，37（4）：373-376.
[16] 杨合同，唐文华，迟建国，等.植病生防菌株B1301的种类鉴定及其对生姜青枯病的作用机理和防治效果[J].中国生物防治，2002，18（1）：21-24.
[17] 欧艳华.拮抗菌TS（4）27的筛选及其抗菌活性物质研究[J].武汉生物工程学院学报，2009，5（1）：1-4.
[18] 周德庆.微生物学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社， 1986.
[19] 东方珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，1978.
[20] SAITO H， MIURA K I. Preparation of transforming DNA by phenol treatment[J]. Biochem Biophys Acta，1963，72：619-629.
[21] SAITOU A N D，NEI M. The neighbor-joining method： a new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Molecular Biology and Evolution，1987， 4（4）： 406-425
[22]COOK R J， THOMASHOW L S， WELLER D M， et al. Molecular mechanisms for biological control of plant pathogens[J]. PhytoPathology， 1995，31： 53-80.
[23] DAVIES J E. What are antibioties？ Arehaic functions for modern activities[J]. Mol Microbiol， 1990， 4： 1227-1232.
[24] 宋建华，童 骁，陈明锴，等.一株高PLC的CW2W29023菌的鉴定[J].微生物学杂志，2002，22（2）：10-14.
