摘要：根据致病性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的致病基因ｒｆｂＥ设计特异性引物扩增出致病性Ｏ１５７：Ｈ７特异性序列，然后分别用常规的琼脂糖电泳技术和Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ对ＰＣＲ产物进行检测，并比较两种检测方法的灵敏度、准确度和重复性。结果表明，Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ的灵敏性较琼脂糖凝胶电泳法高；其能准确地确定片段的大小（误差率小于５％），可提供ＰＣＲ目的片段的质量浓度和摩尔浓度。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ芯片分析系统结合ＰＣＲ方法可对食源性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７进行特异、准确、稳定、灵敏的检测和鉴定，具有重要的推广价值。
关键词：大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７；聚合酶链反应；安捷伦２１００生物分析仪；琼脂糖凝胶电泳
中图分类号：ＴＳ２０７．４；Ｓ８５２．６１＋２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）01－0177-03
Detection of Foodborne Escherichia coli O157:H7 Using Agilent 2100 Bioanalyzer
ＦＥＮＧ Ｊｉａｎ１，ＢＡＩ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｙｕｎ－ｌｏｎｇ２，ＪＩＮＧ Ｊｉａｎ－ｚｈｏｕ１
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｚｈｅｎｇzｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２， Ｃｈｉｎａ；
２．Ｈｅｎａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ through ｂｏｔｈ Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ａｎｄ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｈｅｎ the ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｉｍ ｇｅｎｅ ｒｆｂＥ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ， ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ， ａｃｃｕｒａｃｙ， ａｎｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ． Ｔｈｅ Bｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｓ １０ ｔｉｍｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｓ ｔｈｅ ａｇｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｉｔ ｃｏｕｌｄ provide ｔｈｅ ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｉｚｅ， ｍａｓｓ ａｎｄ ｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｅ. ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７； ＰＣＲ； Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ； ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７是肠出血性大肠杆菌（ＥＨＥＣ）的一个主要血清型，牛、羊、猪等家畜是其主要宿主［１］，人类由于食用被大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７污染的食品或水源而致病。自１９８３年美国Ｒｉｌｅｙ等［２］首次报道大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７可以引起出血性肠炎以来，相继在英国、加拿大、日本等国出现暴发性流行病例。１９８７年我国首次由权太叔等从出血性结肠炎患者粪便中分离到大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７，此后福建、浙江、广东、河北、宁夏等十几个省区陆续分离出该菌［３］。有研究表明，人感染１０个活菌即可致病，导致患者出现剧烈腹痛，引起出血性结肠炎甚至溶血性尿毒综合征［4，５］。
获得快速、敏感、特异的检测方法对于临床诊断和疫情控制是非常必要的。目前，常见的大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７检验方法主要有常规生化分离鉴定法、免疫磁珠法、酶联免疫吸附法、乳胶凝集试验法、基因探针法、聚合酶链式反应法、微生物鉴定仪法等［６－８］。常规生化方法操作复杂、耗时较长；免疫学方法可对大量样品进行筛选，但容易出现假阳性；而聚合酶链式反应法在病原菌的分子检测中已成为一种常用方法，其中敏感性、特异性和可靠性是衡量ＰＣＲ扩增效率的３个重要指标。本试验使用常规的琼脂糖电泳技术和Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ芯片分析系统对食源性致病菌Ｏ１５７∶Ｈ７的ＰＣＲ产物进行检测，比较两种检测方法的灵敏度、准确度和重复性，现将结果报告如下。
１材料与方法
１．１主要材料与试剂
大肠杆菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７∶Ｈ７菌株８６－２４购于广东省微生物菌种保藏中心。
针对ｒｆｂＯ１５７序列（ＧｅｎＢａｎｋＳ８３４６０）筛选以下引物序列［９］，ｒｆｂＥＬ：５′－ＧＴＴＡＧＣＧＴＴＡＧＧＴＡＴＡＴＣＧＧ
ＡＡＧ－３′，ｒｆｂＥＲ：５′－ＣＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＧＴＡＧＴＡＡＴＡＧ
ＴＴ－３′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，目的片段长３７８ｂｐ。７５００ＬａｂＣｈｉｐ试剂盒由Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ提供。
１．２主要仪器
Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ仪器和软件购自Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，所有基于芯片的分离及分析过程均在Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上自动进行。它是通过微流体技术对样品进行分离，当给芯片加电压时，样品便在芯片上的微流道中进行毛细管电泳；在样品流动过程中，不同的ＤＮＡ片段根据其大小被分离。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ可以通过模拟凝胶电泳图和峰值图来显示试验结果。
１．３方法
１．３．１ＰＣＲ反应以各种标准菌株ＤＮＡ作为模板进行特异性ＰＣＲ。ＰＣＲ反应条件为：９４℃预变性５ ｍｉｎ；９４℃、４０ ｓ，６３℃、３０ ｓ，７２℃、１ ｍｉｎ，３０次循环；７２℃延伸５ ｍｉｎ。
１．３．２琼脂糖凝胶电泳分析取上述ＰＣＲ产物６ μＬ进行１．５％琼脂糖凝胶电泳，电压１００Ｖ，３０ ｍｉｎ，然后照相并分析相应长度的扩增条带。
１．３．３芯片检测和分析按照ＤＮＡ ７５００ＬａｂＣｈｉｐ试剂盒所提供的说明进行：①２５μＬ的染料加入到含400 μＬ凝胶的离心管中，充分混合均匀后4 000 r/min离心１０ ｍｉｎ；②９ μＬ的凝胶和染料混合液添加到适当的孔中；③通过一个１ ｍＬ注射器施加一定的压力使混合液进入微流道；再分别加９ μＬ的凝胶和染料混合液到其他两个胶孔中；④５ μＬ的Ｍａｒｋｅｒ添加到每个样品孔以及Ｌａｄｄｅｒ孔；⑤在Ｌａｄｄｅｒ孔添加１ μＬ的分子量标准，在样品孔中分别添加１ μＬ的ＰＣＲ样品；⑥把芯片放在特定的漩涡混合器上２ ４００ ｒ／ｍｉｎ，混合１ ｍｉｎ；⑦迅速把芯片插入Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ仪器进行自动检测分析。
２结果与分析
２．１ＰＣＲ反应的特异性
分别以金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌亚Ⅰ型、金黄色葡萄球菌亚Ⅱ型、沙门氏菌、乙型沙门氏菌、甲型沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌、威尔氏李斯特菌、痢氏志贺氏菌、宋氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌、假结核耶尔森氏菌、大肠杆菌、ＪＭ１０９、ＤＨ５ɑ、大肠埃希尔菌、Ｏ１５７的ＤＮＡ为模板，以ｒｆｂＥＬ和ｒｆｂＥＲ为引物进行ＰＣＲ，电泳结果见图１。由图１可知，除了１８号Ｏ１５７的ＤＮＡ扩出明显条带外，其他的泳道均无扩增条带，表明该引物在ＰＣＲ扩增中的特异性较强。
２．２Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ与琼脂糖凝胶电泳法的灵敏度比较
由图２、图３可知，随着ＤＮＡ浓度的降低，扩增条带的亮度在一定程度上也慢慢降低；在菌液浓度为１０２个／ｍＬ时，琼脂糖的条带已经非常模糊，而Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ的条带虽然亮度减弱，但仍可以明显看出条带。另外，在图２中，１～６号泳道在点样量相同的情况下，由于ＤＮＡ的迁移速率受到多种因素的影响（包括ＤＮＡ浓度、电场强度、缓冲液及荧光染料的嵌入等），条带的迁移表现出一定的差异化。在图３中，１～６号的产物大小基本是一样的，这是因为生物分析仪芯片分析系统可以对样品片段大小和浓度进行校正，这样就减少了样品流经分离管道过程中所产生的轻微变异。由图２和图３的对比可见，利用Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ可提高检测的灵敏度；同时，由于芯片检测系统有配套的试剂盒和标准化的操作方法，从而可以提高结果的重复性和准确度。
２．３Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ与琼脂糖凝胶电泳法对片段大小测定准确度和重复性的比较
由图1、图2可知，目的片段处于３００～４００ｂｐ之间，但具体的大小无法确定，而通过Ａｇｉｌｅｎｔ检测的数据（表１）可以看出Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ不仅能够给出正确的片段大小（误差率小于５％），而且可以同时给出该产物的质量浓度和摩尔浓度。由表１可知，随着样品中加入的菌体ＤＮＡ浓度的降低，ＰＣＲ扩增所得的目的产物的质量浓度和摩尔浓度也在降低，这与前面对菌体浓度的稀释是相呼应的，而在琼脂糖凝胶电泳图中却只能做定性的分析。
３讨论
由于食源性致病菌潜在的致病性和在临床样品中菌量比较少，检测系统的灵敏度就显得尤为重要。Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ的灵敏度决定于它所检测的菌体浓度。有研究表明，输入的目的片段浓度在１０～６５ ｎｇ／μＬ范围内，Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ检测的结果是一样的［１０］。
Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ一次可以分析１２个样品，且从检测开始到结束只需２～３ ｈ，Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ在灵敏度、准确度、重复性上表现出较好的结果。传统的琼脂糖电泳分析需要一个专门放置仪器的空间、电子成像系统以及在制备胶的过程中要接触到一些有毒物质，最后产生一些难以利用的废弃物。
但是Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ在分析ＤＮＡ片段大小差别在８～１２ｂｐ方面还存在一定的困难，这导致它不能够分析片段大小非常相近的ＤＮＡ片段［１１］；这也提示我们，在后续多重ＰＣＲ的研究中各个目的片段大小的差异应大于１２ｂｐ。除此之外，Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ可以给出所有琼脂糖电泳所能检测的ＤＮＡ片段的准确大小，误差率小于５％。
今后，在快速检测肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７方面，ＰＣＲ结合Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ将会成为检测手段中的一种非常有用的工具。
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