对照组相比差异极显著（P<0.01）。[结论]ERK基因所指导合成的蛋白是青蛤重要的免疫信号通路蛋白。
关键词青蛤;ERK基因;PolyI：C;荧光定量PCR
中图分类号S944.4文献标识码A
文章編号0517-6611（2019）01-0099-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.031
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青蛤（Cyclinasinensis）是一种常见的海产经济贝类，其食用味道好而且具有很高的营养价值，青蛤养殖是我国海产品养殖的支柱型产业，青蛤本身具有重要的药用价值[1]。但是随着近年来我国水产行业大环境的恶化，青蛤在养殖过程中出现了大规模的病害和死亡现象，给近海地区的经济带来了巨大的损失[2]。对青蛤的健康养殖、抗病害机制及免疫调控的研究迫在眉睫，这一研究不仅可以为解决青蛤在养殖过程中出现的死亡现象提供初步的理论研究结果，而且可以为进一步研究青蛤及其他无脊椎动物的免疫方式积累重要的试验依据。
Toll样受体（tolllikereceptors，TLR）是原始且保守的免疫系统受体之一[3]。Toll样受体信号通路主要用于调控一些参与免疫的蛋白表达。细胞外刺激作用于细胞需要通过MAPK信号介导的三级激酶级联反应[4]。而细胞外调节蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK）是MAPK家族中的一员，它是将信号从表面受体传导至细胞核的关键。在脊椎动物中已有ERK基因的相关研究，但ERK基因在软体动物中的相关研究鲜见报道。
聚肌胞苷酸（polyinosinic：polycytidylicacid，PolyI：C）是一种人工合成的双链RNA，可模拟病毒进行试验[5]。作为一种高效的诱导剂，聚肌胞苷酸可在鱼类等海产品及临床医学的小鼠模型研究中作为病毒类似物进行侵染试验。该试验中，通过PolyI：C体外注射得到ERK干扰后的基因，以其为模板测定表达量的变化。
免疫生物学研究是水产养殖中病害防治的理论基础。青蛤只具有先天性免疫系统，而抗生素的使用会使生物产生抗药性。所以，研究贝类免疫相关因子的作用机制在发展水产养殖业中刻不容缓。免疫增强剂的研发和使用将在极大程度上发挥贝类的先天特异性免疫调节功能，大大提高贝类抵御病原体的能力，对水环境保护、贝类增养殖业以及水产品卫生安全等都具有重要的意义[6]。
1材料与方法
1.1材料
青蛤采购于天津王顶堤海鲜品市场，暂养于密度1.02～1.04g/cm3的中性海水中，持续供氧，水温22℃左右[7]，投喂5‰小球藻。饲喂大约7d，选取体表完好、个体形态差别较小的青蛤[平均壳宽（19.12±0.56）mm、平均壳长（29.13±1.22）mm、平均壳高（29.51±1.46）mm]进行分组试验。
1.2方法
1.2.1材料处理。
在注射前选取若干青蛤，提取血淋巴、鳃、肝脏、闭壳肌、外套膜组织约50mg冷冻备用;配置浓度约为1μg/g的PolyI：C[8]。将余下青蛤随机分为试验组和对照组，每组设置3个平行。在试验组青蛤的闭壳肌部位中注射PolyI：C50μL，在对照组青蛤中注射等量灭菌海水。分别在注射后的0、3、6、12、24、48、96h提取青蛤的血淋巴。准确称取各组织50mg，冷冻于液氮中备用。
1.2.2青蛤转录组文库的构建。
将提取的青蛤6个组织于液氮中研磨充分后，置于1mLTrizol中提取组织的总RNA。按照QIAGEN公司的OligotexmRNAKits法分离纯化总RNA。用随机引物逆转录法将纯化后的RNA反转录成cDNA。将得到的cDNA末端修饰、加尾等，用以制备整个文库。采用Unigene编码蛋白框ORF预测分析去冗余后的数据，再经Blast分析后，从中筛选得到青蛤ERK基因类似序列。再利用筛选得到的青蛤ERK基因类似序列进行克隆，设计克隆时所用引物CsERK-F1、CsERK-R1（表1）。
1.2.3生物信息学分析。
基因克隆产物与GenBank中的核酸数据库进行BlastX（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析[9]，利用开放阅读框（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）在线分析软件分析其开放阅读框，使用SignalP3.0分析该基因的信号肽序列，利用SMART（http：∥smart.embl-heidelberg.de/）预测结构域，ProtParam工具在线预测此序列的分子量、分子式和等电点，使用ClustalW对氨基酸序列进行同源性分析和多重比对[10]。
1.2.4ERK基因在青蛤各组织内的表达。
利用Trizol法提取青蛤血淋巴、肝脏、外套膜、闭壳肌和鳃的总RNA，后反转成cDNA，放入-20℃冰箱中保存备用[11]。以β-actin基因为内参基因，实时定量引物分别为β-actin-F、β-actin-R（表1）。反应在LightCycler480实时定量PCR仪上进行，扩增体系为20μL，反应程序为94℃预变性30s;94℃5s，60℃10s，40个循环;融解95℃5s，60℃1min，95℃5s;50℃降温30s[12]。
采用2-ΔΔCT法进行数据处理[13-14]，并使用SPSS软件进行数据分析[15]。
1.2.5PolyI：C刺激下CsERK基因在血淋巴内的时序性表达。
利用Trizol法提取青蛤被PolyI：C侵染后各时间点血淋巴的总RNA，反转录成cDNA。荧光定量PCR引物为CsERK-F2、CsERK-R2（表1）。采用2-ΔΔCT法进行数据处理，并使用SPSS软件对数据进行分析。
47卷1期侯梓园等青蛤（Cyclinasinensis）ERK基因的克隆及其在PolyI：C刺激下的表达分析
2結果与分析
2.1青蛤ERK基因的结构
通过生物信息学软件分析得到CsERK基因全长2407bp，开放阅读框长1338bp，共编码445个氨基酸（图1）;具有1个S_Tkc结构域（70～366aa）;理论分子量为50.51kDa，等电点为6.35，分子式为C2225H3498N624O662S29，氨基酸组成中亮氨酸（Leu）最高，占8.8%。该基因无跨膜区;开放阅读框内含1个S-Tkc结构域，从分子进化上看，该基因与光滑双脐螺中的基因相似度最高。该研究的基因在GenBank登陆注册，CsERK注册号为MF974208。
2.2青蛤ERK基因的分子系统学分析
利用NCBI数据库，将CsERK基因与数据库中其他生物的ERK基因进行同源性比对[16]，比对结果利用MEGA5.4软件构建CsERK基因的系统发育树（图2），置信度利用Bootstrap1000个循环拓扑结构进行检验[17]。结果发现，海蜗牛（Aplysiacalifornica）、霸王莲花青螺（Lottiagigantea）、光滑双脐螺（Biomphalariaglabrata）与CsERK基因在同一分支，青蛤ERK基因与光滑双脐螺（Biomphalariaglabrata）ERK基因的同源性最高，高达88%。
2.3青蛤ERK基因的表达分析
2.3.1CsERK基因在组织间的表达分析。
以β-actin基因为对照，使用荧光定量PCR的方法，对青蛤的外套膜、闭壳肌、鳃、肝脏和血淋巴5种组织进行基因的表达量测定，结果如图3所示。根据数据得到，CsERK基因在青蛤5个组织中均可表达，其中表达量最高的组织为血淋巴，剩下依次为闭壳肌、鳃、肝脏，在外套膜中ERK基因的表达量最低。
3结论与讨论
随着科学探究的逐渐深入，对青蛤的研究也从宏观的形态学和繁殖发育等方面逐步向分子水平方向发展[18]。ERK基因是Toll样受体通路MAPK家族中的一员[19]，ERK在脊椎动物中病理学及免疫学研究中已有报道，但在贝类等无脊椎动物中还鲜有研究。
该研究在构建青蛤转录组文库后，筛选出细胞外调节蛋白激酶，并对该基因进行生物信息学分析，得到基本的理论数据。CsERK基因与光滑双脐螺中的ERK基因相似度最高。与青蛤其他基因同源性较高的物种也大多为贝类[20]，如与青蛤AP-1基因同源性最高的物种为盘鲍（Haliotisdiscus）和菲律宾蛤仔（Ruditapesphilippinarum）。由此表明青蛤ERK基因的分子生物学特性与软体动物在分类学上的进化地位保持一致性。
使用荧光定量PCR技术研究了正常生理环境下CsERK基因在体内5个不同组织中的表达情况及外界病毒类似物刺激下血淋巴中时序性表达情况。经qPCR技术检测后显示，青蛤ERK基因在其血淋巴、外套膜、肝脏、闭壳肌和鳃5个组织中普遍表达，血淋巴中表达量最高，其次为肝，外套膜中表达量最少。贝类免疫主要为非特异性免疫[21]，在青蛤体内，血细胞能产生体液因子，例如凝集素、非特异性水解酶、抗菌肽等调控因子[22]。因此，血液在青蛤的免疫系统中起到重要作用，众多贝类免疫相关基因在血淋巴中的表达量显著高于其他组织。青蛤血细胞中的ERK基因上调最为明显，说明血淋巴作为软体动物非特异性免疫防御的首要组织担当着防御的重任，印证了青蛤的非特异性免疫应答机制。
目前贝类的病原菌包括细菌、真菌、病毒等[23]。在体外PolyI：C模拟刺激后目的基因的表达量在3h时开始上升并达到最大值，在6、12h时试验组的表达量发生明显变化。在病毒类似物PolyI：C刺激下该基因的表达量有明显变化，这表明ERK基因作为青蛤体内潜在的免疫相关基因，参与了青蛤应答病毒侵染的免疫反应。
针对近年暴发的青蛤病害现象，从青蛤的分子免疫通路入手，结合生物信息学、分子系统学及分子免疫学手段，对青蛤中的基因进行了研究。对青蛤分子免疫学领域的研究，不仅在提高青蛤存活率、防止青蛤季节性大批量死亡等方面提供了重要的理论基础，而且为其在医药开发方面提供了分子免疫学的理论保障。
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